莴苣1-FFT基因的克隆及其功能分析.pdfVIP

高技术通讯2007年4月第17卷第4期 莴苣1．FFT基因的克隆及其功能分析① 李慧娟② 张学成岳桂东。 张举仁③。 (中国海洋大学生命科学与技术学部青岛266003) (’山东大学生命科学学院 济南250100) (果聚糖：果聚糖1．果糖基转移酶)候选全长cDNA，序列分析表明该基因的开放阅读框中 具有p果糖苷酶单元(蔗糖结合框)、RDP域和EC域三个活性中心城。Soutllem杂交分析 表明该基因在莴苣基因组中以单拷贝形式存在。利用农杆菌介导的叶盘转化法将该基因 转入无1．FFr基因的烟草细胞，获得了转基因植株。体外酶反应证实转基因叶片提取物 中具有1一nT活性，该基因编码l—n丌。 关键词 莴苣，RAcE，果聚糖：果聚糖1．果糖基转移酶基因，转基因烟草 其味甜、热量低，常用作食品添加剂；果聚糖还是一 O 引言 种纤维型益生素，对人体健康有多种促进作用…。 果聚糖(“cta鹏)是由蔗糖与一个或多个果糖基 莴苣(‰似溉)属菊科莴苣属中一、二年生 相连而组成的线型或分支型的多聚体，是水溶性的 草本植物，能形成叶球或嫩叶供食用，尚未见莴苣果 非结构多糖。大约15％的被子植物以果聚糖作为 聚糖代谢方面的研究报道。本文根据已发表的果糖 主要碳水化合物，其主要分布在菊科、百合科和禾本 基转移酶保守区序列设计简并引物，利用RT-PCR和 科植物中。植物中果聚糖主要有5种类型[1|，其中 菊糖型果聚糖(inulin)以p(2—1)键连接一个或多个对其进行了序列分析和酶学性质的初步研究。 呋喃型果糖基为主，偶见』3(2—6)键型的分支，主要 l 材料与方法 存在于菊芋(胁z泐沈珊砌e凇凇L．)、菊苣(位砌矗啪 1．1植物材料、菌株和质粒 泐y6淞L．)、菜蓟(白们口mscDf聊z岱L．)等菊科植物 中。研究表明，菊糖型果聚糖的合成主要涉及两个 莴苣种子购于山东省农业科学院；pGE胛．T Vtor 酶，即蔗糖：蔗糖一1．果糖基转移酶(suclDse：suclDse Easy EC DNA 1一曲c啤lt躺ferase，1．S田I2．4．1．99])和果聚 tIlE咄er、限制性内切酶和胶回收 pol脚I睨配、DNA 糖：果聚糖1．果糖基转移酶(fmctaIl：fmctaIll，hc． 试剂盒均购自‰公司。烟草(№t泐尬渤鲫肌 tof讲喊rase，l—FFr[EC2．4．1．100])。前者将一L．，Wi$ccHlsiIl38)、大肠杆菌DH5a、根癌农杆菌LBA 个蔗糖分子上的果糖基转移到另一个蔗糖分子果糖 4404为本实验室保存。植物表达载体pcAMBI． 基的Cl位上，生成蔗果三糖，这是一步不可逆反应 A1300．35S．Mcs．Tn∞．必由本实验室构建。 过程；后者将蔗果三糖(或DP≥3的果聚糖)上的果1．2 1．n呵基因的克隆 糖基转移到蔗糖或另一个果聚糖分子上，生成不同 取生长—个月的莴苣幼叶置于150nm蔗糖溶液 聚合度的果聚糖，这是一步可逆反应过程[¨]。目 中，23℃12001)【持续光照处理24h后，采用酸酚．异硫 前，已从菊芋[2f、菜蓟[5J、琢2锄枞r[6]和小麦 (劢砌删￡溉L．)【7J中克隆了l一肿基因，并进(Q工f屺EN公司)和sⅣ幽州m彤气哑cDNAAmpJificati帆 行了果聚糖代谢方面的相关研究。果聚糖不仅是一 种重要的贮藏性碳水化合物，而且也是一种重要的 第—链。引物合成和测序工作由