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.2 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略 j4:Xel/ ?1.2.1 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理 8|{d1dy ?在 外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问 题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。越来越多 的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究[52; 53]。P.pastoris能根据细胞生长环境（碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫）来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降 解最主要的场所[54]，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶， 细胞外膜结合蛋白酶（cell-bound proteases）[55]和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的[5]。胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信 号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养[22]。 bo-L|RO ?根 据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶（vacuolar proteases），细胞基质蛋白酶体（the cytosolic proteosome）以及分泌途径的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）[52; 56]。 onU\[VvM ?表1.2　毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶[57] 0`i(l4]l ?Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathway[57] Z,oC
kv(n ?Enzyme ? ?Type ? ?Gene ? ?Zymogen form ] T#bNK\1 ?Vacuole ? ?PrA ? ?Aspartic ? ?PEP4 ? ?Yes fZp3g%u ?? ?PrB ? ?Serine ? ?PRB1 ? ?Yes -%dBZW\u2 ?? ?CpY ? ?Serine ? ?PRC1 ? ?Yes Kk).KgR ?? ?CpS ? ?Metallo-( Zn2+) ? ?CPS1 ? ?Unknown h=4 GSU ?? ?ApI ? ?Metallo-( Zn2+) ? ?LAP4 ? ?Yes Oye6IT ?? ?ApCo ? ?Metallo-(Co2+) ? ?DAP2 ? ?No \YSprXe ?? ?DPAP-B ? ?Serine ? ?SEC11 ? ?Unknown TolD2cyf ?Secretory pathway signal peptidase ? ?Kex2 protease ? ?Serine ? ?KEX2 ? ?Yes pL . 0_ ?? ?Kex1 carboxypeptidase ? ?Serine ? ?KEX1 ? ?No ?GISiABQC ?? ?DPAP-A ? ?Serine ? ?STE13 ? ?Unknown,predict no F-XAI 3 ?? ?Yeast aspartyl protease ш ? ?Aspartic ? ?YAP3 ? ?Unknown,predict yes ph Q{wzwp ?酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80％的蛋白在液泡中降解[57]。 ;sW4j nt ?在P.pastoris生长和表达外源蛋白过程中，由于碳源从葡萄糖或甘油到甲醇的改变，甲醇代谢酶系 （AOX,FAD,DHAS等）和过氧化氢体逐步积累，同时，相应的蛋白酶也产生了。由于细胞器胁迫的影响，过氧化氢体一部分在基质中自噬降解，大部分过 氧化氢体转运到液泡中得到降解[58]。 Sx8CS5r ?P.pastoris 中位于与细胞膜结合的胞内蛋白酶类可分为蛋白质水解酶（内切酶）和多肽外切酶，由蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶类组成[53]。所有的蛋白酶都是由其蛋白酶前体 经过酶切活化而成，按照其作用活性位点又分为4类，丝氨酸类蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸类蛋白酶