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DNA基础知识.doc
Chelex 法提取血液(斑)DNA
原理:
Chelex 是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂,其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子的作用,防止在其煮沸过程中DNA 的降解,在高温低离子强度下也起着催化DNA 释放的作用。
对检材的条件要求
液体血用EDTA 溶液(0.5M EDTA:血=50μl:3ml)或枸橼酸钠溶液(2.5%枸橼酸钠:血=1:4)抗凝,勿用肝素抗凝,须冷藏保存送检。
操作步骤:
1、取4μl血液(或3×3mm2血斑样品)放入0.5ml的离心管中,加入0.5ml纯水,振荡混匀,室温浸泡15-30 分钟。
2、13,000rpm 离心3 分钟,去除上清液〔上清液可用于做抗人血红蛋白(FOB)金标试剂条检验〕,若是血斑则保留载体。
3、加入200μl 5% Chelex-100 溶液,56oC 保温15-30 分钟,振荡5-10 秒。
4、沸水中煮8 分钟(或在热循环仪上100oC 保温8 分钟),振荡5-10 秒。
5、13,000rpm 离心3 分钟,4oC 保存备用。
注意事项:
1、5% Chelex-100 溶液使用前摇匀,用量视检材的量而定。
2、液体血用EDTA 溶液(0.5M EDTA:血=50μl:3ml)或枸橼酸钠溶液(2.5%枸橼酸钠:血=1:4)抗凝,冷藏送检。
3、液体血涂在滤纸或脱脂纱布上制成血斑时,应在室温下自然晾干,放入纸袋内送检。
4、血斑应保留载体,皮革上的血迹最好用纱线转移提取。
5、纯水洗一次后,若颜色还很红,可用水再洗一遍。
6、微量血斑可不经水洗,直接加入适量5% Chelex-100 溶液保温。
7、陈旧血斑可加入蛋白酶K,并适当延长保温时间。
Chelex 法提取唾液(斑)DNA
适用范围:
该方法适用于各种载体上的唾液斑,常见的有口腔拭子、烟蒂、邮票、信封折口、
牙刷、果核、饮料罐、水杯、面罩及咬痕等。
原理:
Chelex 是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂,其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子的作用,防止在其煮沸过程中DNA 的降解,在高温低离子强度下也起着催化DNA 释放的作用。在Chelex 中加入蛋白酶K,有助于口腔上皮细胞的消化。
操作步骤
1、取3×3mm2唾液斑样品(过滤嘴纸质外层、唾液斑转移纱线)或剪取牙刷刷毛1束,放入0.5ml的离心管中,加入0.5ml纯水,振荡混匀,室温浸泡15-30 分钟。
2、13,000rpm 离心3 分钟,去除上清液,保留载体。
3、加入100μl 5% Chelex-100 溶液和5μl 2mg/ml 蛋白酶K,56°C 保温2 小时以上,
振荡5-10 秒。
4、沸水中煮8 分钟(或在热循环仪上100°C 保温8 分钟),振荡5-10 秒。
5、 13,000rpm 离心3 分钟,4°C 保存备用。
注意事项:
1、多枚烟蒂应分别放入不同纸袋内送检,标明商标和提取地点。
2、口腔拭子应在室温下自然晾干,放纸袋内送检。
3、饮料罐、水杯口上的唾液斑可分两步提取转移,先用湿棉签或纱布擦拭,再用干棉签或纱布擦拭,一并放入离心管中提取DNA。擦拭时尽量少用载体。
4、对于量少的检材可不经水洗,直接加入5% Chelex-100 溶液和蛋白酶K 保温。
Chelex 法提取组织DNA
适用范围:
人体的各种器官组织如心脏、脑、肌肉、软骨及毛根等。
原理:
Chelex 是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂,其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子的作用,防止在其煮沸过程中DNA 的降解,在高温低离子强度下也起着催化DNA 释放的作用。在5%的Chelex-100 中加入蛋白酶K 溶液,有助于组织细胞的消化和DNA 释放。
操作步骤
1、剪取组织约1mg,放入0.5ml 的离心管中,加入200μl 5% Chelex-100 溶液和10μl的2mg/ml 蛋白酶K;剪单根毛发的毛根,加入50μl 5% Chelex-100 溶液和5μl 2mg/ml的蛋白酶K,56oC 保温2 小时以上,振荡5-10 秒。
2、沸水中煮8 分钟(或在热循环仪上100oC 保温8 分钟),振荡5-10 秒。
3、13,000rpm 离心3 分钟,4oC 保存备用。
注意事项
1、焚烧的尸体应取深层肌肉,严重腐烂尸体应提取软骨。
2、多根毛发的毛根应分别提取DNA。
3、带毛根的毛发干燥状态下保存送检,组织应冷冻保存送检。
4、组织DNA 含量较大,取材时不要过量。
5、若组织表面较脏,应先用纯水冲洗,去除烟尘、泥土等杂质。
6、毛根表面若粘有血迹或其他斑迹,应先用脱脂棉蘸纯水擦拭干净。
Chelex 法提取指(趾)甲DNA
适用范围
该方法适用于人类指(趾)甲。
原理
指(趾)甲的主要成份为α-角蛋白,也含有人体细胞。在二硫代
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