动物营养代谢病第七章营养代谢病检测技术.docVIP

营养代谢病检测技术 第七章 本章目的： 本章要求了解营养代谢病检测技术的基本知识。 本章重点： １、血糖、蛋白质和脂肪代谢及微量元素测定。 ２、消化吸收代谢过程 本章难点： 维生素测定。 第一节　蛋白质检测 第二节　血糖检测 第三节　脂肪代谢的检测 第四节　微量元素检测 第五节　维生素营养的检测 主要内容 一、血清总蛋白测定 二、血清白蛋白测定 三、血清蛋白电泳 四、血红蛋白测定 五、肌红蛋白测定 第一节　蛋白质检测（Ketosis in dairy cows） 一、血清总蛋白测定 原理： 碱性溶液中蛋白质分子的肽键与铜离子作用，形成紫红色的复合物。这与两个尿素分子缩合生成缩二脲，在碱性条件下与铜离子作用形成紫红色反应相似，故称为双缩脲反应。 一、血清总蛋白测定 试剂： 6mol/L氢氧化钠溶液：溶解120g氢氧化钠于去离子水中，稀释至500ml，置聚乙烯瓶内盖紧保存。 双缩脲试剂：称3 g CuSO4?5H2O和9g酒石酸钾钠（KNaC4H4O4?4H2O），先分别溶于蒸馏水，加入碘化钾5g，待完全溶解后混合，加入6mol/L氢氧化钠100ml，最后以蒸馏水加至1L置聚乙烯瓶内盖紧贮存。 蛋白标准液：收集混合血清，用凯氏定氮法测定蛋白质含量，亦可用定值参考血清或标准蛋白作标准。 一、血清总蛋白测定 操作： 取三支试管按下表加入式样，混匀 37摄氏度水浴放置十分钟，以空白管调零，540nm波长测定吸光度。 项目 测定管 标准管 空白管 血清/ml 1.00 － － 蛋白质标准液/ml － 1.00 － 理生盐水/ml － － 1.00 双缩脲试剂/ ml 5.00 5.00 5.00 二、血清白蛋白测定 原理：在pH=4.2环境中，带正电荷的白蛋白（pI=4.9）可以与阴离子染料溴甲酚绿（BCG）结合，溶液由黄变蓝，在波长630nm具有最大光吸收，并与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。 二、血清白蛋白测定 试剂： 溴甲酚绿（BCG）试剂：于1L容量瓶中盛蒸镏水约400ml，加琥珀酸缓冲贮存液100ml，用吸管准确吸取BCG贮存液8ml加入，并将内壁沾的染料冲洗入液体中，加叠氮钠存液2.5 ml，聚氧化乙烯月桂醚贮存液2.5ml，最后用蒸馏水稀释至刻度，配好的BCG试剂pH应为4.15 ± 0.05。 白蛋白标准液：40g/L，也可用定值参考血清。均需置冰箱保存。 二、血清白蛋白测定 操作： 血清白蛋白（g/L）= (Odu/Ods) ×标准白蛋白浓度（g/L） 同时测定血清总蛋白浓度，减去血清白蛋白浓度，可得血清球蛋白浓度，并可计算血清白蛋白/球蛋白比值。 三、血清蛋白电泳 电泳：带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。 应用1. 分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2. 分析某种物质的纯度及分子量 电泳的基本原理 电场中推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。 F＝QE 质点前移受阻力（F）影响，球形质点服从Stoke定律，即：F′＝6πrην（r半径，η介质粘度，ν质点移速） 质点在电场中稳定运动时：F＝F′即：QE＝6πrην 同电泳条件下不同物质因其分子大小（r）和带电量（Q）差异而有不同泳动速度，因此，一定时间可分离。 按其泳动速度从正极端起〔即速度最快）依次为白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等条带，有的动物α-球蛋白和β-球蛋白可分为两个条带。 血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。 醋酸纤维素（二乙酸纤