NK活性测定.ppt

自然杀伤细胞 属淋巴细胞；无特异性TCR；无须致敏即直接杀伤靶细胞。 表面标记 CD3-、CD56+、CD16+ 表面受体 （1）杀伤细胞活化受体（KAR） 结合靶细胞表面糖类配体，促使NK发挥杀伤作用。 （2）杀伤细胞抑制受体（KIR） 识别自身细胞表面MHC-I类分子，产生抑制信号。 主要生物学功能 抗感染与抗肿瘤；免疫调节 * NK活性测定 何谓NK？—NK概述 NK活性测定 实验原理 实验材料及试剂 实验步骤及结果判读 NK细胞的表面标志 杀伤细胞抑制性受体（KIRs） NK细胞识别正常细胞 NK细胞识别靶细胞 NK细胞通过ADCC作用杀伤病毒感染的靶细胞 NK细胞杀伤靶细胞电镜图 胞 核 125I释放法 荧光染料释放法 NK细胞+靶细胞 靶细胞溶解、破裂释放 胞浆内酶类 LDH释放法 胞浆内蛋白 51Cr释放法 实验原理 效应细胞 靶细胞 释放LDH 乳酸 乳酸脱氢酶 LDH NAD+ NADH+H+ PMS NBT 甲替（OD570nm） 丙酮酸 实验材料 1、LDH底物溶液（临用前配制） 2、1% NP-40 3、1mol/L柠檬酸终止液 NBT（硝基氯化四氮唑蓝） 4mg NAD+（氧化型辅酶I ） 10mg PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 1mg 混匀后取1.6ml，加1mol/L乳酸钠0.4ml 加入2mlddH2O溶解 加入0.1mol/L pH7.4的PBS至10ml 实验步骤 效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞） 靶细胞的制备 效-靶细胞相互作用 酶促反应 结果判读 取培养24~48hr的靶细胞 K562 , 洗涤3次（1000rpm×10min）, 最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml, 备用。 靶细胞的制备： 效应细胞的制备 （分离外周血单个核细胞） 采集静脉血2ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝 吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中， 将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入抗凝血 离心2000rpm×20min 密度梯度离心分离淋巴细胞亚群 用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度 （加入0.2ml完全RPMI-1640 ，混匀） 将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次 2000rpm×5min 用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板， 再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层） *