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酶的组织化学 酶组织化学反应主要经过两步： 1.酶促反应，即酶催化细胞内相应底物，生成无色的初级反应底物。 2.显色反应，捕获和偶联。将初级反应产物与捕获剂反应，经过一步或两步反应生成有色的最终反应产物，或将初级反应产物与一些偶联剂发生偶联反应生成有色沉淀，显示酶活性部位。 遵循原则： 1.尽量保持组织细胞生活时的形态和结构。 2.尽量保持组织细胞生活时酶及其他成分的活性，不影响酶的活性和分布。 3. 底物和辅助剂必须迅速而同步地渗透到组织和细胞中去。 4. 底物最好只能被一种酶催化分解。 5. 尽量减少初级反应产物在组织细胞内的弥散程度。 6.. 反应产生的最终反应产物应是不溶于水的有色而稳定的物质，沉积于原位，其颜色深度与物质含量或酶活性应有一定量效关系。 7. 由于酶的活性可受到很多因素影响，因而在酶生化方面有许多要求，以保证充分显示酶的活性： 最适孵育温度（25-37。C） 最适pH值 最适底物及辅助物浓度 激活剂与抑制剂 酶的组织化学方法基本原理 沉淀反应法 1. 金属盐法（金属阳离子沉淀反应）由于酶的活性可使孵育底物分解，其生成的基团可与金属离子结合而产生沉淀，最后在酶的活性部位生成不溶性的有色金属盐沉淀。如钙-钴法显示碱性磷酸酶。 2. 偶联偶氮色素法 由于酶活性可使含萘酚的底物化合物分解，其分解产物可与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性的偶氮色素，以证明酶的活性部位。 电子传递法 根据氧化还原的原理显示氧化酶和脱氢酶。脱氢酶的作用使底物脱氢氧化，脱下的氢可与作为受氢体的无色四唑盐或双四唑盐结合，后者被还原成甲或双甲潜紫蓝色沉淀。如琥珀酸脱氢酶显示方法属于此法。 水解酶类 水解酶催化下列反应 ： AB+H2O AH+BOH 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。 碱性磷酸酶钙-钴显示法 原理：AKP在有激活剂（Mg++）存在和pH9.4时，将磷酸盐底物分解产生磷酸根离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的钙盐所捕获，在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀，再加入硝酸钴，用Co2+置换 Ca2+ ，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色需通过硫化铵处理形成黑色硫化钴颗粒沉淀，显示酶活性所在部位，此沉淀与AKP含量成正比。 试剂配制： 1. 作用液 2%巴比妥钠 5ml；3%β-甘油磷酸钠 5 ml；2%无水氯化钙 10ml；0.1%硫酸镁 0.5 ml；蒸馏水 2.5 ml。 此液pH为9.4，如不到9.4，可用0.1N NaOH调节。 ????2. 2% 硝酸钴 3. 1-2% 硫化铵 （现配） 操作步骤 1. 新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育液37。C 10-40 分钟。 2. 流水洗2分钟。 3. 2%硝酸钴5分钟。 4. 蒸馏水洗。 5. 硫化铵30秒-1分钟。 6. 蒸馏水洗。 7. 甘油明胶封固。 碱性磷酸酶 结果： AKP所在部位呈黑色硫化钴沉淀。 对照 去底物对照，作用液中以蒸馏水代替β-甘油磷酸钠，其他步骤同上，酶反应阴性。 氧化还原酶 催化氧化还原反应的酶。 琥珀酸脱氢酶（SDH）硝基四唑盐法 原理：琥珀酸脱氢酶（SDH）作用于底物琥珀酸钠，脱下氢，以无色的硝基四唑盐为受氢体，后者获氢后被还原为不溶于水的有色甲潜，原位沉积于酶活性部位。 试剂配制 0.2M磷酸缓冲液pH7.6 5ml 1．A液 0.2M琥珀酸钠 5ml B液 0.1%（1mg/ml）硝基四唑盐（Nitro-BT） 10ml 临用前将两液等量混合，调整pH至7.6。 操作步骤： 1. 新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育液37。C 5-40分钟。 2. 蒸馏水洗。 3. 甘油明胶封固。 琥珀酸脱氢酶 结果： 酶活性部位为紫蓝色颗粒沉淀。 对照 另配一孵育液，以等量的蒸馏水代替0.2M琥珀酸钠液，酶活性部位呈阴性。 注意事项： 1. 取材要迅速，立即低温冷冻，否则容易引起酶的扩散。 2. 为节省染液，可采用滴染，使孵育液盖过切片，置于湿盒内孵育。 3.若孵育液中加二甲亚砜1ml，可使线粒体的膜通透性增加，作用快，酶定位清晰。 * * 6-磷酸 葡萄糖酶 结果： 酶活性处为棕黄色硫化铅沉淀，细胞核为阴性反应。