关于丁卡因引导海拉细胞系凋亡的初步研究.doc

丁卡因抑制HeLa细胞增殖和诱导凋亡的体外实验 组员：陈浩、江林松、曲仲阳、毕海洋 摘要：丁卡因对角膜细胞有诱导凋亡的作用。原因可能是：药物本身对脊髓直接刺激诱导细胞凋亡。因此，我们尝试对HELA细胞进行丁卡因处理，初步确定丁卡因对HELA细胞增殖、凋亡影响。为此，我们设定了一系列的丁卡因浓度梯度，通过对相同条件培养的HELA细胞在不同时间、不同浓度下进行计数。通过与正常生长的对照组进行比较初步确定丁卡因对HELA细胞生长的影响。 关键词：丁卡因、HeLa细胞系、细胞凋亡、细胞计数 国内目前对于丁卡因的研究主要集中在丁卡因作为麻醉剂使用的药效及副作用上，对于细胞增殖的抑制和细胞凋亡的诱导并不常见。有研究发现，丁卡因对角膜细胞有诱导凋亡的作用，同时，尤美琴等发现2% 丁卡因对脊髓细胞有损伤，促进细胞的凋亡。原因可能是：药物本身对脊髓直接刺激诱导细胞凋亡；凋亡相关基因bax与bcl-2在丁卡因致脊髓神经系统毒性损伤后的各时相点的异常表达，可能参与了脊髓毒性损伤的发生和发展，但也不能排除它是由于丁卡因对脊髓血流的影响、渗透压的作用等因素所致。因此，我们尝试对HELA细胞进行丁卡因处理，初步确定丁卡因对HELA细胞增殖、凋亡影响，为进一步寻找治疗子宫颈癌确定方向。 本次试验的主要目的在于研究丁卡因对Hela 细胞的体外作用和了解和探索科研实验的方法。 1.材料与方法 1.1 实验材料 实验中所用到的主要用品如下： C02培养箱（37℃、5%C02），4℃冰箱（保存胰酶及培养基），灭菌锅，烘箱；75%酒精，脱脂棉棉球，蒸馏水及三蒸水；24孔培养板，移液管，胶皮头；丁卡因：用完全培养液配制0.1%母液。吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色液： 用PBS配制100μg/mL AO 溶液，100μg/mL EB 溶液，按1：1混合使用。 根据计划取一24孔培养板，34支移液管，3个细胞培养瓶 1.2实验方法 1.2.1接种培养 以上用品准备完毕之后开始进行接种培养。在严格无菌操作的情况下分别对24孔自一侧连续标记为1、2、3……24 以每孔1 ×105个Hela 细胞接种于24孔培养板，每孔1ml细胞液，过夜培养； 1.2.2药品加入 吸出1~6号孔的细胞培养液，然后再依次用1mL移液管添加1mL新的细胞培养液（即未加药培养液），丁卡因浓度：0%（1%=1g/100mL）；这六组为对照组，实验组每次计数均需对一个对照组进行计数处理。 吸出7~10号孔的细胞培养液，然后再依次添加0.75mL（750μL）新的细胞培养液和0.25mL（250μL）丁卡因母液，此处以下的步骤最好使用移液枪添加，丁卡因浓度：0.25%（1%=1g/100mL），4x稀释；此组为母液4倍稀释丁卡因组。 吸出11~16号孔的细胞培养液，然后再依次添加0.975mL（97.5μL）新的细胞培养液和0.025mL（2.5μL）丁卡因母液，丁卡因浓度：0.025%（1%=1g/100mL），40x稀释；此组为母液40倍稀释丁卡因组。 吸出17~24号孔的细胞培养液，然后再依次添加0.975mL新的细胞培养液和0.015625mL（约15.6μL）丁卡因母液，丁卡因浓度：0.015625%（1%=1g/100mL），64x稀释；此组为母液64倍稀释丁卡因组。 封盖后置于适当的培养条件下培养。 1.2.3观察记录 分别按以下六个时间点对空白组及部分对照组进行观察，并记录实验统计结果，整理观察记录：培养开始后2h（空白、4x），4h（空白、4x），12h（空白、40x），24h（空白、40x、64x），32h（空白、40x、64x），48h（空白、64x） 每次观察记录的确切操作包括以下几步： 每次观察前，应填写实验时间，先对24孔板内的各细胞逐孔进行显微观察，出现变异情况，或细胞显现凋亡小体等，则进行拍照，文字记录。 取出接种细胞的24孔培养板，计数3个小孔（包括2个实验组和1个对照组）内的细胞密度，具体方法如下： 就原培养液，用滴管对3个孔底部进行吹打,将细胞完全吹下；收集细胞悬液于青霉素小瓶中，混合均匀后用血球计数板计数。实验组和对照组分别计数3次，细胞数量取平均值。 将未观察的剩余细胞重新放回适宜条件下培养，并记录放回时间。 1.2.4细胞凋亡的检测（吖啶橙/溴化乙锭双染色法） 1.取上步实验中细胞，1000r/min离心 10min，收集细胞，用1mL无血清RPMI 1640培养液悬浮细胞，计数后将细胞密度调整为 2×106-107个/mL。 2.取 0.1mL 细胞悬液，加入 4μl 吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）溶液（按1：1的比例），于室温下边轻微混合边染色 1min。 3.取已染色细胞悬液 10ul 滴于载玻片上，加盖玻片后置荧光显微镜下观察照像。 2结果及分析