MTHFR基因与冠心病相关性调查研究实验记录.docVIP

MTHFRC677T基因与冠心病相关性调查研究实验记录 DNA的提取 一、试剂配制 溶血试剂: 0.32M蔗糖 55g 1MTris-cl(PH:7.5) 0.5ml 0.005M Mgcl2 1g 1%TritoneX-100 5mg 加水至 500ml 注：①1MTris-cl(PH:7.5)：称取24.23gTris于200ml蒸馏水中，用浓Hcl调PH值为7.5。 ②1%TritoneX-100：量取2ml TritoneX-100原液，加蒸馏水至200ml。 ③溶血试剂的配制：称取55g蔗糖及1g Mgcl2置于大烧杯中，同时加入5ml1%TritoneX-100和500ul Tris-cl(PH:7.5)，使其充分溶解，定容至500ml。 细胞裂解液(STE)缓冲液: Tris-cl(PH:7.5) 10mmol/L Nacl 10mmol/L EDTA 1mmol/L 注：称取0.30285gTris，0.1461g Nacl及0.0731gEDTA，置于大烧杯中，加蒸馏水使其充分溶解，定容至250 ml。 TE缓冲液: Tris-cl(PH:7.4,7.5,8.0) 10mmol/L EDTA(PH: 8.0) 1mmol/L 注：称取0.12114gTris及0.2923gEDTA，置于小烧杯中，加蒸馏水使其充分溶解，定容至100 ml。 裂解液: STE 900ul 10%SDS 60ul 蛋白酶K 12ul 注： ①10%SDS：称取20g SDS，置于小烧杯中，加蒸馏水使其充分溶解，定容至200 ml。 饱和酚、氯仿、 氯仿:异戊醇(24:1) 3molNaAC 无水乙醇、70%酒精,放入-20℃预冷 二、DNA提取步骤: 1.将血样(EDTAK3抗凝)从-40℃冰箱取出置室温下融化,同时将其编号记录. 2.提取白细胞: ①将血液到入50ml离心管中,用溶血试剂反复冲洗采血管,加入约20ml. ②将50ml离心管盖紧瓶盖后,至于旋涡混匀器上充分震荡混匀. ③将50ml离心管放入大离心机4000rpm离心15min,弃上清. ④加20ml溶血试剂重复一次, 并4000rpm, 离心10min,弃上清,沉淀即为淋巴细胞. 3.裂解白细胞: ①向装有沉淀物的离心管中加入900ul STE, 60ul 10%SDS, 12ul蛋白酶K后,将沉淀重悬分别移入2个1.5mlEP管中. ②55℃水浴锅中处理2h. ③100℃煮沸7 min,然后立即放入-20℃冷却5 min. 4.酚.氯仿抽提DNA. ①向每个1.5mlEP离心管中加入等体积的酚(约480ul饱和酚),将盖子盖紧后颠倒混匀后12,000rpm, 离心5min,小心将上清移入新的离心管中. ②加入等体积的氯仿:异戊醇液约480ul, 混匀后12,000rpm, 离心5min,小心将上清移入新的离心管中. 5.乙醇沉淀DNA: ①加入水相体积1/10的3molNaAc和2倍体积的冰冻保存的无水乙醇,充分混匀后放-30℃冰箱冷却30 min,取出后12,000rpm, 离心10min, 弃上清. ②加入1ml70%酒精(-20℃预冷), 随即12,000rpm, 离心10min, 弃上清,至于4℃冰箱使其自然干燥. ③次日将每管加入20ul的TE缓冲液保存. PCR扩增 一、试剂配制 1.TagDNA聚合酶,10×buffer，Mgcl2，dNTPs等购与华美生物工程公司北京分公司. 2.引物的合成:根据文献设计两对引物,序列分别为: Forward:5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′ Reverse:5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′ 引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成,按合成后