PI染色检测细胞周期protocol.docVIP

PI染色检测细胞周期protocol1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。 2、加入预冷70%乙醇，于4固定过夜，或-20长期固定（4过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20，有资料说-20可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。 3、细胞染色 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-1004℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。 4、流式分析 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。 分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。 ?细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。 结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后） CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。Flow Cytometric Analysis of Cell Cycle Fixation 1) Collect 2?106 cells. 2) Pellet cells by spinning at 1,000 rpm, 4°C for 5 minutes. 3) Resuspend cell pellet in 1 ml of cold PBS. 4) Fix cells by adding 4 ml of -20°C absolute ethanol. 5) Store cells at -20°C in this fixation buffer until ready for analysis. (No more than 2 weeks) Staining 6) Centrifuge (as above) fixed cells and resuspend pellet in 1 ml of PBS. 7) Add 100 μl of 200 μg/ml DNase-free, RNaseA and incubate at 37°C for 30 minutes. 8) Add 100 μl of 1 mg/ml propidium iodide (light sensitive) and incubate at room temperature for 5-10 minutes. 9) Place samples in 12 X 75 Falcon tubes and read on Becton Dickinson FACStarPLUS. PI染液配制（100ml）：PI 5mg、RNase 2mg、1.0%Triton X-100 0.25ml、生理盐水65ml、枸橼酸纳100mg，加蒸馏水至100ml，调pH值7.2-7.6，用棕色瓶子分装，4℃避光保存。注意事项：1在细胞固定时一定要将细胞吹开，吹成单细胞；??????????2 固定液：70%酒精 要在-20 预冷；??????????3 细胞要选用活力高的。 流式细胞PI单染中为什么用RNAse？在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI很容易透过细胞膜和DNA结合，但RNA也是核酸，也会被染色，为避免干扰染色前需用RNAse降解 RNA。这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。 做流式细胞时，PI 染色，PI的浓度应该是多少?还有就是400目的筛网是什么？100ug/ml，一般用400目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的，否则会出现人为的多倍体干扰，分析的时候需要的是单个的细胞，不过如果经验丰富也 可以gate掉的。如果你没有条件，建议在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色PI的配置 deardeer：PI怎样配制？怎样保存？有的文献说要用柠檬酸钠溶解，这对实验有影