siRNA导入细胞的策略.docVIP

siRNA导入细胞的策略 siRNA导入哺乳动物细胞的策略 RNAi在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能成功的进行RNAi的问题在于使siRNA导入细胞常见的做法是将靶向特定基因的大约碱基长短的双链，或者是—50-mer的发夹结构（）转染到细胞。通过质粒表达同样可以抑制特定基因的表达。—50-mer的发夹结构（）转染到细胞。在细胞内会自动被加工成为，从而引发基因沉默或者表达抑制。?????胞内表达siRNA，尽管细节各有不同，但载体大都是用聚合酶（）启动子启动编码的序列。选用启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成，遇到—5个连续的即终止，非常精确。当这种带有启动子和编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。采用这种方法的优点在于，通过表达质粒的选择标记，载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，这就能够显著降低制备的成本。 ????? pSilencer? siRNA 表达载体系列是用于在培养的哺乳动物细胞中表达的一系列载体。在载体上包含有启动子，氨苄抗性基因和大肠杆菌复制子，只要将编码一小段对应目的基因特异序列的、其能形成发夹结构的序列插入载体中启动子的下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出发夹结构的，这种很快在细胞中加工成为。 ????? 这些表达载体已经成功地在细胞中抑制了包括、、、在内的多个基因的表达。实验表明：能够被化学合成或者体外合成的抑制的基因同样可以被表达相同序列的载体生成的抑制。 ????? 载体是采用小鼠启动子。是由哈佛大学开发的载体，已经成功地在、和细胞中敲除了和的表达。这个载体经过和酶切线性化和纯化，先合成一对的寡核苷酸，带有个碱基的突出，一起退火、快速连接就可以转化。 这两个载体带有不同的启动子，带的是人的启动子，则是用启动子（的一个组成部分）。这两个载体都是用和线性化并且经过纯化的，方便定向克隆。 ）]. Genes Dev,2002,16:948-958. 3，Yu JY DeRuiter L Tumer DL .RNA interference by expression of ghoriinterfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells [J].Proc Natl Acad Sci USA ,2002, 99:6 0 47- 6 0 52 4，Timmons L ,Fire A. fire A.Specificinter ference by ingested dsRNA[L]Nature ,1988,3:95-854 5，kennerdell JR ,Carthew RW .Use of dsRNA mediated genetic interference to demonstrate that frizzledand frizzled 2 actin the wingless pathway.Cell, 1 998, 95(7):1 0 1 7～ 1 0 2 6 6，Tavernarakis N , Wang SL,Dorovkov M,et al.Heritable and inducible genetic interference by double stranded RNA encoded by transgenes [J].Nat genet, 2 0 0 0 , 2 4(2 ):1 80～ 1 83 7,Chuang CF,Meyero witz EM. Specific and heritable genetic interferencebydouble -stranded RNA in Arabidopsis thaliana [Ｊ]. Proc.Natl.Acad.Sci.USA . 2 0 0 0 , 97:4985～ 4990 广州市锐博生物科技有限公司 GUANGZHOU RUIBO BIO CO., LTD www.siRNA.cn 　广州市经济技术开发区·广州科学城·广州国际企业孵化器 A区 A1007室（邮编：510663） Guangzhou Science Park, China.Tel: 8620 Fax:8620Web sit