免疫组化及PCR操作流程.docVIP

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免疫组化及PCR操作流程.doc

细胞免疫组化步骤 1.??PBS冲洗两次 2.??丙酮固定10min 3.??浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃ 30 min 4.??PBS振洗2次,每次3min 5.??加封闭血清,湿盒内37℃ 30 min 6.??弃去血清 7.??加一抗, 37℃ 30~60min (1:200 1:150稀释) 8.??PBS振洗3次,每次3min 9.??加二抗, 37℃ 30 min 10.??PBS振洗3次,每次3min 11.??加ABC复合剂, 37℃ 30 min 12.??PBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1次,每次3min 13.??浸入新鲜底物溶液(DAB50mg+100ml THB),在室温下暗处10~20min 14.??自来水洗5min 15.??染核 浸入苏木素染液2min,自来水洗,迅速过盐酸酒精, 自来水洗,过氨水,自来水洗 16.??逐级脱水,70%1次,95%2次,无水3次 每次1min 17.??透明,过二甲苯3次,每次1min 18.??封片 将有细胞的一面向下封片 一、 免疫组化操作规程 (一)、仪器设备 1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉;2)水浴锅 (二)、试剂 1)PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L,KH2PO4 1.4mmol/L。 2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。 3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。 6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7)封裱剂: a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合; b、油和TBS(或PBS)配制。 8)TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。 (三)、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟。 1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟; 2)无水乙醇中浸泡5分钟; 3)95%乙醇中浸泡5分钟; 4)70%乙醇中浸泡5分钟; 2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1)抗原热修复 (1)高压热修复在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡5分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 (2)煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95左右,放入组织芯片加热10~15分钟。 (3)微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5~10分钟,反复1-2次。适用的抗原有:AR,Bax, Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras, Rb,TopoismeraseⅡ等。 2)酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37,切片也预热至37,消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37时间为30 分钟。适用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。 3、免疫组织化学染色 SP法 1)脱蜡、水化; 2)PBS洗2~3次各5分钟; 3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟; 4)PBS洗2~3次各5分钟; 5)抗原修复; 6)PBS洗2~3次各5分钟; 7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体

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