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反义核酸药物的研究现状 兽医学院药理05研 王冬梅 2005227018 摘要 反义药物以其合理设计药物的可能性和精确的特异引了人们的注 意，但反义药物的研究并非如人们最初预想的那样简单。本文从其特异性，稳定性，透过靶细胞的能力，作用强度，活性判定，给药途径，安全性和毒性，生产成本等诸方面对反义药物的研究现状，现存问题进行了综述。相信伴随这些问题的解决，反义药物很可能成为药典的一部分，给疾病的治疗带来益处。 关键词 反义寡核苷酸；反义药物；基因治疗 反义核酸药物即反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，ODNs)其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA互补，抑制或封闭该基因的转录和表达，或诱导RNaseH识别并切割mRNA，使其丧失功能。反义核酸药物是药理学的新领域或革命，即:新的药物——反义寡核苷酸；新的药物受体——mRNA；新的受体结合方式——Watson-Crick杂交；新的药物受体结合后反应：(1)RNaseH介导的靶RNA的降解；(2)抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。应该说，ODNs治疗比传统的治疗有更高的特异性。从70年代末到现在二十年过去了，反义核酸药物已从实验室研究进入市场。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen上市后，人们对反义疗法更为重视。 ODNs可以作为研究工具，用于对一些特定蛋白和基因的生理功能的研究，也可作为治疗药物用于病毒性疾病、心血管系统疾病!癌症和感染性疾病等许多疾病的治疗。然而，开发这些药物并非易事，首先，消除单个基因的能力还需要进一步的证实，而且一些不期望产生的非反义作用逐渐显现出来。虽然，某些非反义作用也肯定有治疗价值，但由于非反义作用通常是不可预知的，因此，难以以此来合理设计药物。 目前的研究现状及存在的问题主要有以下几个方面： ODNs能否以序列依赖的方式调节特异蛋白的功能 反义核酸药物尽管存在一些非特异的作用，但仍能在体内外结合到特异的RNA上，选择性地减少靶基因的产生而产生药理学作用。 为了解决这一问题，科学家通常需要设计多个针对不同RNA区域的ODNs，找出作用较强和选择性较高的ODNs；另外，在设计反义化合物时，注意选择特别易于遭受攻击的靶基因或靶点；此外，反义ODN的长度也与特异性有关，一般来说，越长其特异性越高，大于17个碱基的寡核苷酸与非靶基因杂交的可能性不大，但在体内经过代谢过程可能使链长度缩短，仍有可能与非靶基因结合。目前，反义ODN的长度多为15~20个碱基，一般可在统计学上保证其特异性。总之，经过认真的选择，设立合适的对照并作出剂量反应曲线，通过大量和仔细的实验，ODNs作为有效的研究工具和治疗药物是可能的。 需要提及的是，理论上靶基因或靶序列在基因组里只出现一次，但目前还从未证实反义核酸药物具有只敲除一个基因的能力。 另外，一些ODNs的作用来自于它的非反义作用，这似乎是不利的，但只要该作用有益，而且有高的治疗指数，仍然有临床应用价值。如抗凝血酶的寡核苷酸，就以其非反义机制产生作用，现在该药正在进行临床前的实验。还有另一个非反义寡核苷酸，即整合酶的抑制剂也正作为抗HIV药用于临床实验。 二、Ns在体内的稳定性 反义寡核苷酸必须不被内源性核酸酶降解，并被送到靶细胞内才能产生最大的效应。ODNs虽能用病毒载体转入细胞内，但考虑到安全性和临床的应用，促使人们研究和开发非病毒转移系统，即对ODNs作化学修饰和结构改造。 化学修饰可以增加反义ODN的稳定性。方法主要有：(1)改变立体构型，如由天然的糖苷键改为A型；(2)ODN的磷酸二酯键被甲基!乙基和硫等化学基团取代和修饰；(3)ODN的末端修饰，如连接疏水基团——胆固醇；(4)肽核酸(peptidenucleicacids，PNAs)用多肽取代磷酸二酯键，肽核酸在化学上与肽和蛋白质更为接近，是一类非常有希望的基因治疗药物，最近有许多研究进展。开发PNA作为治疗药物在不久的将来可能产生突破，PNA的反义活性已在培养的神经细胞甚至在大鼠脑内注射后得到证实。 在化学修饰中，硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioateoligodeoxy2nucleotide，PS2ODN)是最为广泛应用的，现在进入临床的所有ODNs几乎都是PS2ODN，称第一代反义药物，它有良好的溶解性、杂交性和稳定性，并能诱导RNaseH。在细胞系的研究中，证实它可以抑制靶mR2NA的表达长达24~48小时。若重复给药或加以其它修饰，则可延长其作用时间。在整体情况下，PS-ODN的血浆半衰期(T1/2A和T1/2B)依给药的剂量和动物种属的不同，可以持续数分钟至数小时不等。其排泄主要通过尿。它的代谢过程比较复杂，但大部分降解产物似乎都是由3’—外切核酸酶产生的。 应用多种化学修饰将更为有益。最近的研究证