实验二质粒DNA的制备.pptVIP

实验二 质粒DNA的制备 一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA 的提取方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质，混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。 三、实验材料与主要试剂 实验材料：含质粒的大肠杆菌DH5α 主要试剂： 溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L； 溶液II：NaOH溶液（内含1% SDS）：0.2 M； 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸，28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） 氯仿 TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，其中含RNA酶（RNaseA）: 20 μg/ml 醋酸铵（pH7.5～8.0）: 7.5 mol/L 异丙醇；70%乙醇；无水乙醇。 四、实验步骤 1) 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。 2) 离心(8 000rpm，1分钟)，弃上清液。（如想提取多一点DNA，再吸取1.4 ml菌液至同一离心管中，离心，弃上清液） 3) 加入150 μL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。 4) 加入200 μL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。 5) 加入150 μL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5分钟。 6) 离心(14 000rpm，10分钟,4 ℃)，移取上清液于另一干净离心管。 7) 向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。 8) 移取上层水相溶液（约450μL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 rpm，5分钟)，溶液将出现分层。 9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30分钟。 10) 离心(14 000rpm，10分钟，4℃)，倒掉上清液。 11) 加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5 分钟，倒掉上清液。 12)真空抽干或室温自然干燥 13）加30~40μL TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10分钟，降解RNA杂质，琼脂糖凝胶电泳或-20℃保存备用。 14)琼脂糖凝胶电泳（1%）：称取0.5g琼脂糖粉末，加入50ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5μL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。 15）每位同学各取5μL质粒DNA加入1μL 6×loading buffer混匀，进行点样。 16）电泳条件：120v，25分钟；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。 五、实验结果 观察并分析电泳图片 * *