实验五小鼠肝细胞线粒体超活染色及观察.docVIP

实验五：小鼠肝细胞线粒体超活染色及观察 一、实验目的 1、掌握解剖小鼠的基本技术与方法； 2、掌握线粒体的超活染色原理及方法；?? 3、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 二、实验原理 1、线粒体 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿?B（Janus?green?B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。?? 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。? 线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。 2、活体染色 活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。? 活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电? 化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性? 或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最? 常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。因此，活细胞一般不能被台盼蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。 三、实验材料和用品 1、材料：小鼠； 2、器材和仪器：解剖盘、镊子、剪子、盖玻片、载玻片、显微镜、滴管、双凹片、10ml烧杯； 3、试剂：Ringer 溶液 (NaCl 0.85g，KCl 0.25g，CaCl2 0.03g，H2O 100ml) 、 1%詹纳斯绿B原液: 50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，滤纸过滤。用时稀释至0.02%。 四、实验步骤 1、用断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝组织，选取中间较厚的肝组织0.5cm3，放入小烧杯中，用Ringer液冲洗去血污； 2、在干净的凹面载玻片的凹穴中, 滴加0.02% 詹纳斯绿B溶液，再将肝组织块移入染液中，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(—般需染20～30min)； 3、吸去染液，用眼科剪将组织块着色部分剪下重置小烧杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，用剪刀充分剪碎制悬液； 4、取上述细胞悬液滴片，加盖玻片，在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜下观察，可见具有l～2 个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。? 五、实验结果 1、线粒体超活染色图片（10×40） 图一：小鼠肝细胞线粒体超活染色（10×40） 小鼠肝细胞线粒体超活染色结果（内部被染成蓝绿色的为线粒体） 小鼠肝细胞线粒体超活染色结果（内部被染成蓝绿色的为线粒体） 图二：小鼠精细胞线粒体超活染色结果10×40 结论：由图可知，小鼠肝细胞质中的线粒体被染成蓝绿色（理想状态下），且分布均匀 六、讨论与结论 1、注意事项 a.在从小鼠体内取肝组织块时要尽量快，从而能够保证它更高的活性。? b.染色时要使组织块上面部分半露在染液外，不可完全淹没，以便使线粒体酶系得到氧化。? c.?染色结束后，加入的Ringer液的量不能太多，只需要刚盖过肝组织块即可。如果量太多，则在剪组织块的时候会造成其上浮，从而不易剪碎。? d. 观察前要将肝组织充分剪碎，制片时