实验四温度pH对酶活性的影响.docVIP

实验四　温度、pH对酶活性的影响 Ⅰ　温度对酶活性的影响 【目的和要求】 通过检验不同温度下唾液淀粉酶和脲酶的活性，了解温度对酶活性的影响。 【原理】 酶的催化作用受温度影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度每升高10℃，反应速度增加一倍左右，最后反应速度达到最大值。另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可使蛋白质变性，导致酶失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。大多数动物酶的最适温度为37℃－40℃，植物酶的最适温度为50℃－60℃。但是，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。通常测定酶的活性时，在酶反应的最适温度下进行。为了维持反应过程中温度的恒定，一般利用恒温水浴等恒温装置。 酶对温度的稳定性与其存在形式有关。实践证明大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定，能在室温下保存数月以至一年。溶液中的酶，一般不如固体的酶稳定，而且容易被微生物污染，通常很难长期保存而不丧失其活性，在高温的情况下，更不稳定。 【操作方法】 脲酶能催化尿素水解生成氨和二氧化碳，氨可与奈斯勒试剂作用生成橙红色化合物。由颜色深浅，可断定反应进行的程度。 NH2 ︱ C ︱ NH2 = O＋H2O 2NH3＋CO2 脲酶 取4试管，编号。向每支试管中，各加入脲酶提取液1ml。将第1号试管放在冰水里冷却，第2号试管在室温下放置，第3号试管在50℃恒温水浴中保温，第4号试管在沸水浴中煮。5min后向4支试管中各加入1%尿素溶液1ml。混匀，10min后取出4支试管，将第3、4号试管用流动的自来水冷却至室温。然后，向4支试管中各加奈斯勒试剂5滴，摇匀。观察比较各试管颜色深浅，并说明温度对脲酶活性的影响。 【试剂和器材】 一、试剂 （1）1％尿素溶液 （2）脲酶提取液：取黄豆粉6g，加30％乙醇250ml，振荡10min，过滤。可保存１－２星期。 （３）奈斯勒(Nessler)试剂：称取５g碘化钾，溶于5ml蒸馏水中，加入饱和氯化汞溶液(100ml约溶解5.7g氯化汞)，并不断搅拌。直至产生的朱红沉淀不再溶解时，再加40ml　50%氢氧化钠溶液，稀释至100ml，混匀，静置过液，倾出清液存于棕色瓶中。 奈斯勒试剂是含有大量汞盐的强碱性溶液，所以，它是具有腐蚀性的剧毒试剂。实验时必须严格遵守操作规程，谨防中毒。此外，作酶学实验时所用的玻璃仪器等一切器皿必须洁净，以除去能抑制酶活性的杂性。因此，用奈斯勒试剂作完实验后，将它所沾污的试管等一切器皿充分洗涤干净。 二、器材 （1）试管和试管架 （2）吸量管（1、2ml） （3）烧杯（500、100ml） （4）锥形瓶（100ml） （5）玻璃漏斗 （6）水浴锅 （7）铁三脚架 （8）煤气灯 （9）恒温水浴 （10）滤纸 【思考题】 　　 　　1．什么是酶的最适温度？有体实践意义？ 2．奈斯勒试剂的成分是什么？为什么可用它来检查脲酶的活性？使用中应注意什么？ 3．酶在干燥的状态下与水溶液中，它的活性受温度的影响是否相同？这个性质对酶的保存有体意义？ 4．酶反应的最适温度是酶的特征物理常数吗？它与哪些因素有关？ Ⅱ　pH对酶活性的影响 【目的和要求】 　　　1．了解pH对酶活性的影响。 　　　2．学习测定酶的最适pH的方法 【原理】 酶的活性受环境pH的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活性。一种酶表现其活性最高时的pH值，称为该酶的最适pH。低于或高于最适pH时，酶的活性降低。不同酶的最适pH值不同，例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5 ，胰蛋白酶的最适pH为8等。 应当指出酶的最适pH受底物性质和缓冲溶液性质的影响。例如，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。 【操作方法】 取8个50ml锥形瓶，编号。按下表中的比例，用吸量管添加0.2M磷酸氢二钠溶液和0.1M柠檬酸溶液，制备pH5.0-8.0的8种缓冲溶液。 锥形瓶号 0.2M磷酸氢二钠（ml） 0.1M柠檬酸（ml） 缓冲液pH 1 5.15 4.85 5.0 2 5.80 4.20 5.6 3 6.31 3.69 6.0 4 6.92 3.08 6.4 5 7.72 2.28 6.8 6 8.69 1.31 7.2 7 9.36 0.64 7.6 8 9.72 0.28 8.0 取9支干燥的试管，编号。将8个锥形瓶中不同pH的缓冲液各取3ml，分别加入相应号码（1－8）号的试管中。然后，再