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凡纳滨对虾血蓝蛋白小亚基启动子的研究 ——实验方案 第一部分 血蓝蛋白小亚基启动子序列克隆 一、 凡纳滨对虾基因组DNA提取 1、用注射器从健康凡纳滨对虾心脏处抽取20μl血细胞装入提前加有20μl抗凝剂无菌Ep管中。 2、室温5000rpm离心3min收集血细胞，采用基因组DNA提取试剂盒提取凡纳滨对虾血细胞基因组DNA。 3、使用微量紫外分光光度计（NANoDRoP 2000C）和琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度，-20℃保存备用。 二、染色体步移技术扩增血蓝蛋白小亚基5-UTR 1、根据课题组前期所得的血蓝蛋白小亚基启动子设计PCR引物，具体见表1-1。 表1-1 HcS基因步移引物 引物 序列 退火温度 Primers Sequences Tm（℃） HcS-SP1 TCTCGGACTCGGCCATATGCTCAAT 70.0 HcS-SP2 CATACCTGCACTGGCCACCTGAAAG 68.9 HcS-SP3 ATATATACCCGAAGTGCGTGGAGTT 62.7 2、以所提基因组DNA 为模板，采用Genome Walking Kit 试剂盒扩增5-UTR。 具体步骤如下： （1）1 st PCR，10 μl 反应体系， dNTP Mixture（2.5 mM each） 4 μl 10×LA PCR BufferⅡ（Mg2+ plus） 2.5 μl TaKaRa LA Taq（5∪/μl） 0.25 μl 上下游引物各 0.5 μl 基因组DNA 1 μl(20ng/μl) ddH2O 1.25 μl 反应条件：94℃ 1 min；98℃ 1 min；94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min， 5 个循环；94℃ 30 s，25℃ 3 min，72℃ 2 min；94℃ 30s，65℃ 1 min，72℃ 2 min，94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min94℃ 30 s，44℃ 1 min，72℃ 2 min， 15 个循环；72℃ 10 min；4℃ 保存，取PCR扩增产物3μl进行琼脂糖凝胶电泳分析； （2）取上述PCR产物0.5μl至1μl用去离子水稀释100倍用于第二轮反应。 10 μl 的反应体系如下 dNTP Mixture（2.5 mM each） 4 μl 10×LA PCR BufferⅡ（Mg2+ plus） 2.5 μl TaKaRa LA Taq（5 U/μl） 0.25 μl 上下游引物各 0.5 μl 第一轮 PCR 反应液 0.5 μl ddH2O 1.75 μl 反应条件：94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min，94℃ 30 s，65℃ 1 min， 72℃ 2 min，94℃ 30 s，44℃ 1 min，72℃ 2 min，15 个循环；72℃ 10 min；4 ℃ 保存；4℃ 保存，取扩增产物3μl扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳分析； （3）根据第二轮反应，取所得产物1μl用去离子水稀释100倍用于第三轮反应，10 μl 的反应体系如下， dNTP Mixture（2.5 mM each） 4 μl 10×LA PCR BufferⅡ（Mg2+ plus） 2.5 μl TaKaRa LA Taq（5 U/μl） 0.25 μl 上下游引物各 0.5 μl