核酸杂交的基本原理.docVIP

核酸杂交的基本原理 原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形成双链。 基因组探针CDNA探针 RNA探针的特点 基因组DNA探针：为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 制备：基因克隆；PCR扩增基因组特定片段 优点：多克隆在载体中的DNA片段，可以无限繁殖，量大；PCR制备探针更加简便省时。 cDNA探针：指互补于mRNA的DNA分子。 制备：以mRNA为模板，按照碱基互补的原则，经逆转录酶催化合成的。 优点：不存在内含子和高度重复序列，是一种较为理想的核酸探针。 RNA探针：以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。 优点：稳定性高，杂交效率高， 缺点：易于降解和标记方法复杂。 探针标记的方法 理想的探针标记物应具备以下特性： 敏感性高； 标记物与探针结合后，不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值； 检测方法要高灵敏性、高特异性、稳定、简便、假阳性率低； 标记对环境污染小，对人体无损伤，价格低； 标记物对检测方法无干扰。 放射性同位素标记 放射性同位素标记法 缺口平移法 随机引物法 DNA探针的末端标记5’端标记法3’端标记法 PCR标记DNA探针 非放射性标记 酶促反应标记法 化学修饰标记法 各种固相杂交方法的适用范围 杂交类型 检测目的及范围 Southern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子 Northern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子 菌落杂交 检测固定在膜上、经裂解从细菌体释放的DNA分子 斑点杂交 检测固定在膜上的DNA或RNA分子 原位杂交 检测细胞或组织中的DNA或RNA分子 1、Southern印迹杂交 Southern印迹杂交：膜上检测DNA的杂交技术，1975年由Edwin Southern建立。 广泛应用于基因克隆的筛选、特定DNA的定性定量检测、基因突变分析、疾病的临床诊断等方面 Southern印迹杂交基本方法： 酶切已纯化的待测DNA 凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性 将DNA片段转移到固体支持物 预杂交封闭滤膜上非特异性位点 探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针 检测及结果分析 A. DNA的变性：DNA变性解链是杂交成功的重要环节。 Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性，通常采用碱变性方法，即将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/L NaCl和0. 5mol/L NaOH中1小时左右。 B. 中和：取出凝胶用去离子水漂洗一次，然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl(pH8.0)和1.5mol/L NaCl中和1小时。 C. Southern印迹：目的是将电泳变性后的DNa片段转移至固体支持物上。固体支持物种类较多，有硝酸纤维素膜、尼龙膜、磁珠等。 将DNA分子从凝胶中转移到固体支持物上的方法有3种： 毛细管转移：单链DNA在高盐的作用下从琼脂糖凝胶转向固体支持膜。 电转移法：利用电泳作用将凝胶中变性DNA转移至带电荷的固相支持物上。 真空转移：将固相膜放在真空室上面的多孔屏上，再将凝胶置于滤膜上，通过低压真空泵在转移装置上形成负压，缓冲也从上面的一个贮液槽中流下，洗脱出凝胶中的DNA，使其沉积在滤膜上。 D. 预杂交：待测DNA与探针进行杂交前，需将上面得到的薄膜进行预杂交。 预杂交的目的是用非特异性的DNA分子及其他高分子物质，将待测核酸分子中非特异性位点全部封闭。 E. 杂交：单链核酸探针与待测核酸分子中特异序列在一定温度下复性，形成异质双链的过程。 F. 洗膜：将游离的探针分子和非特异性杂交分子漂洗掉的过程。 G. 杂交信号的检测 2、 Northern印迹杂交 Northern印迹杂交：应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术，是有Alwine于1977年建立，后经Thomas等人改进，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。 其方法类似于Southern印迹杂交。 A.基本步骤 B.与Southern印迹杂交比较：基本原理相似，操作程序略有差异： RNA极易降解，提取过程中需注意RNA酶污染； 杂交前实验过程中所用器材最好与Souther印迹实验的分开使用，防止RNA酶的污染； RNA变性的方法与DNA不同； 印迹前将含甲醛(变性剂)的凝胶用水冲洗掉，然后再印迹、杂交； 如果测定RNA片段大小，可在同一块胶上加上分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。 5.原位杂交 定义：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针，与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。