核酸杂交的定义.pptVIP

Southern Blot 核酸杂交的定义 杂交（Hybridization）：如果把不同的DNA链放在同一溶液中做变性处理，或把单链DNA与RNA放在一起，只要有某些区域（当然也可以是链的大部分）有成立碱基的可能，它们之间就可形成局部的双链，这一过程称为核酸杂交。 Southern Blot: 检测DNA Northern Blot: 检测RNA Southern Blot的原理 DNA经过标准琼脂糖电泳按分子大小分离，再经原位变性，从胶上转到固相支持物上。附于膜上的DNA可以与标记的DNA，RNA或寡核苷酸探针杂交，通过特定的检测方法如放射自显影可以确定与探针互补的条带位置。 尼龙膜（阳性电荷）：400-500?g核酸/cm2 变性转移液：0.4mol/L NaOH、1mol/L NaCl 水相缓冲液杂交溶液：6*SSC 预杂交液： 6×SSC（或6×SSPE） 5×Denhardt试剂 0. 5% SDS 1?g/ml poly A 100?g/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA 探针 Southern Blot操作流程 1、将DNA转移至尼龙膜; 2、尼龙膜洗涤、固定； 3、与探针杂交； 4、成像或显色。 1、将DNA转移至尼龙膜 1）电泳结束后，将凝胶转移至一玻璃干燥皿，用刀片修除凝胶的无用部分，切去凝胶右下角，以便帮助在以后的操作中辨认凝胶的方位。 2）将凝胶置变性转移液（0.4mol/L NaOH、1mol/L NaCl中浸泡15分钟并不断温和地摇动例如置旋转平台上）使DNA变性，更换溶液并继续浸泡20分钟，注意缓慢地摇动之。 3）凝胶浸于变性－转移液中的同时，按如下方法准备尼龙膜： a．用一干净解剖刀或切纸刀裁制一张长度和宽度均比凝胶约大1mm的膜。处理膜时应戴手套并用平头镊子（如Millpore镊子）操作。 b．将膜漂浮于一盘去离子水的液面上直至由下而上完全湿润，然后将其浸入变性转移液中至少5分钟，用一干净的解剖刀片切去膜的一角，以便与凝胶的切角相对应。 4）从变性液中取出凝胶，将凝胶翻转以使其背面向上。把凝胶放于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。 5）用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流短路现象是导致凝胶中的DNA的转移效率下降的主要原因。 6）在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝胶之间不应留有气泡。 7）用2×SSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，湿润的滤纸放置在湿润的硝酸纤维素滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。 8）切一叠（5～8cm高）略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃板，然后用一500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的变性DNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。 9）使上述DNA转移持续进行8～24小时，每当纸巾浸湿后，应换新的纸巾。 10）转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的3MM滤纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。 2．膜的洗涤、固定 1）从膜上剥除凝胶并弃去，将膜置于0.5mol/L Tris·Cl（pH7.2）、1mol/L NaCl中，于室温浸泡15分钟，如此对膜进行中和并除去粘附在其上的琼脂糖。 2）将膜从中和液中提出，待拖带的多余液体流去，使膜平铺于一张纸巾上，于室温干燥30分钟以上。 3）从如下两种方法中任选一种，将DNA固定在膜上： a．将干燥的膜放至两张3MM滤纸之间，在真空烧箱或普通烘箱内于80℃烘烤0.5－2小时。 b．将尼龙膜携带DNA的一面暴露于一紫外光源（254nm）之下。 3、杂交 1）配制手头实验所需的适量预杂交液。每平方厘米硝酸纤维素滤膜或尼龙膜约需预杂交液0.2ml。 2）将含有靶DNA的硝酸纤维素滤膜或尼龙膜漂浮于一盘6×SSC（或6×SSPE）的液面上，待其由下至上完全湿润，将滤膜浸入液体内泡2分钟。 3）将湿润滤膜装入可加热封接的袋中，按每平方厘米硝酸纤维素滤膜或尼龙膜0.2ml的量加入预杂交液。尽可能将袋内空气压挤出来，用加热封接机封住袋子开口的一边，将其浸入适当温度（以水为溶剂用68℃；以50%甲酰胺为溶剂用42℃）的水浴中温育1～2小时。 4）如果放射性标记的探针为双链，则于100℃