碱性裂解液提取DNA法在环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用.docVIP

描述：目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代 小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，... 　　【摘要】?目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代 小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，PCR扩增COX-1和COX-2基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型作出鉴定。结果：碱 性裂解液法提取的DNA能应用于子代小鼠的不同基因型的鉴定，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、杂合子（COX-1+/-；COX-2+ /-）和纯合子（COX-1-/-；COX-2-/-）。结论：建立了碱性裂解液提取DNA法，并将该法成功应用于环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中。　　环氧化酶（COX）催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）产生前列腺素类物质，其中在心血管系统主要是前列环素（PGI2）和血栓烷A2（TxA2），COX作为AA代谢中主要的关键限速酶之 一，在心血管方面发挥重要的病理生理作用。COX主要包括COX-1和COX-2两种亚型，由于现阶段COX亚型选择性抑制剂存在着非特异性作用， 因此基因敲除小鼠对进一步明确COX亚型的生理及病理生理功能具有重要作用，进而建立COX亚型基因敲除小鼠的鉴定方法也就尤为重要。目前，国内基 因敲除小鼠鉴定中DNA的提取主要有两种方法，第一种即采用蛋白酶K消化后用经典酚氯仿提取法：通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，再加入乙 醇即可使DNA分离出来；第二种即基因组DNA试剂盒提取法：通过裂解细胞释放出基因组DNA，然后加入核糖核酸酶A去除RNA，接着选择性沉淀去除蛋 白，最后通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。碱性裂解液提取DNA法鲜见报道。因此，本实验将建立一种用碱性裂解液提取DNA的方法，为 COX亚型基因敲除小鼠鉴定提供更为方便、经济、快速的方法。　　1 资料与方法　　1.1 一般资料 实验动物：COX亚型基因敲除小鼠引进于北京大学医学部生理系，基因背景为COX-1+/-的杂合子小鼠2雌1雄，基因背景为COX-2+/-的杂合子小 鼠2雌1雄，共6只。试剂：PCR试剂盒、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；重要溶液地配制：溶液A，即NaOH溶液，成分为25 mmol/L NaOH、2 mmol/L EDTA，溶液B的成分为40 mmol/L Tris·HCl，pH值为8.0。仪器：干式恒温器（奥盛仪器有限公司，中国），PCR扩增仪（ABI公司，美国），电泳仪（北京六一仪器厂，中国）。　　1.2 方法　　1.2.1 基因组DNA提取 COX基因敲除小鼠按照SPF级动物饲养标准进行饲养。温度控制在22 ℃，光照周期为12 h黑暗，12 h光照；笼具、垫料、饲料和饮水均经过高温高压灭菌处理后使用；自由取食和饮水，垫料一周更换两次。采用1雄和2雌合笼方式进行繁殖。在子代小鼠断乳打耳 号进行标记时，留取小鼠耳缘组织于1.5 mL EP管中，加入100 μL溶液A，于干式恒温器100 ℃孵育30 min。再加入100 μL溶液B，充分震荡混匀、离心，放入4 ℃冰箱备用。　　1.2.2 基因组DNA扩增 （1）COX-1引物序列：WT-S：　　5’-AGGAGATGGCTGCTGAGTTGG-3’，KO-S：5-’GCAGCCTCTGTTCCACATACAC- 3’，WT/KO-AS：5’-AATCTGACTTTCTGAGTTGCC-3’。目的基因片段长度为601 bp。各种基因型小鼠扩增片段为：COX-1-/-：646 bp；COX-1+/-：601 bp和646 bp；COX-1+/+：601 bp。COX-2引物序列：WT-S：5’-ACACACTCTATCACTGGCACC-3’，KO- S：5’-ACGCGTCACCTTAATATGCG-3’，WT/KO-AS：5’-ATCCCTTCACTAAATGCCCTC-3’。目的基因片段 长度为905 bp。各种基因型小鼠扩增片段为：COX-2-/-：905 bp；COX-2+/-：760 bp和905 bp；COX-2+/+：760 bp。（2）PCR体系：2× Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，引物WT-S（10 μmol/L）2.5 μL，引物KO-S（10 μmol/L）2.5 μL，引物WT/KO-AS（10 μmol/L）2.5 μL， 耳缘DNA模板样品1.5 μL，ddH2O补