质粒提取中常见的问题.docVIP

质粒DNA提取常见问题分析 1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？ DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。解决方法：将细菌的用量增加。 2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？ 1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。解决方法：将细菌用量减半。 2）细菌悬浮不充分,存留小菌块, 导致菌体未被有效裂解。解决方法：注意将细菌悬浮充分。 3）加Solution III后中和不充分。解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。 4）Solution II出现沉淀。解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。 5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代 Solution II使用。 3.出现严重的RNA污染？ 1）未在Solution I中事先加入RNase A1。解决方法：补加RNase A1。 2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。 3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。 4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？ 1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。解决方法：使用新鲜培养的细菌。 2）宿主菌富含核酸内切酶。解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。或者将质粒DNA进行乙醇沉淀。 3）质粒DNA在Solution II中暴露过久，易造成质粒DNA的切口断裂。裂解步骤控制在5分钟内完成。 4）培养的细菌被杂菌污染。解决方法：重新挑取单菌落培养细菌。 5.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现基因组DNA的污染？ 1）菌体裂解和中和过程中,剧烈混合造成基因组DNA断裂所致。解决方法：温和地进行菌体的裂解和中和。 2）加Solution II时操作时间过长，造成基因组DNA断裂所致。解决方法：将裂解步骤控制在5分钟内完成。 3）细菌的质量差（反复冻融的细菌，陈旧的细菌，培养条件不合适的细菌等）中有许多断裂或降解而游离的基因组DNA，使用生长良好的新鲜细菌。 6.加样时DNA飘出加样孔外？ Rinse B的操作步骤。解决方法：按说明书的操作步骤操作以确保残留的Rinse B被甩干。 7.为什么提出的质粒的多是二聚体和多聚体形式？ 8.质粒为何会丢失？ 16小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 9. 大肠杆菌老化： 10. 质粒拷贝数低： DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 11. 菌体中无质粒： 12. 碱裂解不充分： (以天根生化的质粒小提试剂盒中的溶剂配置为例)溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 13. 溶液使用不当： P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 14. 吸附柱过载： TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 15. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ： 16. 乙醇残留： 17. 洗脱液加入位置不正确： 18. 洗脱液不合适： DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。 19. 洗脱体积太小： 20. 洗脱时间过短： 1分钟可达到较好的效果 1