质粒载体的构建.doc

质粒载体的构建 摘 要：关键词：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。PCR技术的基本原理　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2PCR反应’向3’方向的延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链. （70-72℃ 30-60s） 以上三个步骤为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板,经过n次循环后,目的DNA以2n形式增加. 2.1.2.2 PCR检测 PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法Pyrobest 2ul buffer（10x） 10ul WT4（模板） 2ul P2a（10uM） 4ul P2b（10uM） 4ul dNTP（2.5x） 2ul ddH2O 76ul PCR反应条件: 94℃ 5min 30 cycles: 94℃ 40s 53℃ 40s 72℃ 2min30s 72℃ 10min 4℃ forever 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（方法见2.1.3电泳）,切胶回收目的DNA条带,共切3管,分别标注A、B、C.首先用25ul约60℃的无菌蒸馏水洗脱A管一次,洗脱液标注1,分别用15ul的无菌蒸馏水洗脱B管和C管,得到的DNA洗脱液标注2,最后各用30ul的无菌蒸馏水洗脱A、B、C管,得到的DNA洗脱液分别标注a、b、c. 第二次PCR扩增（带酶切位点）: 分别用DNA的洗脱液2、a、b、c为模板,进行第二次PCR扩增,设计反应体系（各25ul）如下: 模板2 模板a 模板b 模板c Pyrobest 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul buffer（10x） 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul 模板 0.5ul 2ul 4ul