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转录组分析 刘志强 海洋大学 一.什么是转录组及转录组学 转录组：一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和。 转录组学：是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。 二.研究转录组的方法 1.表达序列标签测序(EST) (1)原理 EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单向一次测序获得的短的cDNA 部分序列，代表 一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ± 120bp 。EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。 （2）操作流程 组织样品mRNA的提取→逆转录合成 cDNA→构建cDNA文库→测序 （3）表达序列标签测序在转录组中的运用 通过对cDNA文库EST分析可以揭示用以构建cDNA文库的相应组织或细胞中mRNA的真正水平，因此可以通过大规模的EST分析研究表达图谱，以此得出特定组织类型在特定生理状态或是特定的发育阶段下基因表达情况。 2.基因表达系列分析（SAGE） （1）原理 基因表达系列分析（SAGE）是通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列。在此方法中，通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA标签，并通过PCR扩增和连接，随后对连接体进行测序。 （2）操作程序 a.以biotinylated oligo(dT）为引物反转录合成cDNA，以一种限制性内切酶（锚定酶 ）酶切. b.将cDNA等分为A和B两部分，分别连接接头A或接头B。每一种接头都含有标签酶酶切位点序列. c.用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和B扩增 d.用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序. e.对标签数据进行处理 （3）.基因表达系列分析（SAGE）在转录组研究中的应用 a.SAGE能够快速、全范围提取生物体基因表达信息，对已知基因进行量化分析。 b.SAGE也能应用于寻找新基因。 c.SAGE可用于定量比较不同状态下的组织细胞的特异基因表达。 d.SAGE能够接近完整地获得基因组表达信息，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。 3.特征序列的大规模平行测序（MPSS） （1）原理 大规模平行测序技术(MPSS)是以DNA测序为基础的大规模高通量基因分析新技术，通过标签库的建立、微珠与标签的连接、酶切连接反应和生物信息分析等步骤，获得基因表达序列 （2）操作流程 a.以寡核苷酸引物oligo—dT，来自细胞或组织的mRNA为模板合成为cDNA双链。 b.限制性内切酶消化cDNA片段，纯化消化的cDNA片段． c.将纯化的cDNA片段重组到含有标签序列的载体中,并通过标签上的PCR引物扩增插入片段．酶切消化线性化PCR产物，生成含cDNA片段与标签相连接的产物.将cDNA模板连接到微球体上． d.cDNA序列测定 (3)大规模平行测序（MPSS）在转录组研究中的应用 根据MPSS技术的原理可以知道，MPSS一方 面可提供某一cDNA在体内特定发育阶段的拷贝数，另一方面还可测定出相应cDNA 的序列，所以这就为在转录水平上进行基因表达分析提供了强有力的定性和定量手段，很明显，这一技术首先可以应用于不同丰度基因的差异表达分析，制作基因转录图谱 4.基因芯片技术 （1）原理 该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息.包括点阵列基因芯片和原位合成基因芯片。 （2）操作流程 a.芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和点阵列的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。 b.样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中DNA或RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度。 c.杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。 d.信号