RNA操作指南.docVIP

RNA实验方法附录 一、RNA抽提注意事项 * 尽可能无RNA酶的环境下操作，最好有专门场所* 耗材的处理：电泳槽需0.5 M NaOH处理过夜后DEPC水清洗试管氯仿浸泡处理后DEPC水清洗枪头和eppendorf管DEPC水浸泡后灭菌处理* 实验者本身防护：一次性手套，口罩等* 启盖前震荡离心管有助于防止气溶胶形成* 正确的操作方式 二、RNA操作常见问题分析 可能原因 解决方法 产量太低 样本裂解或匀浆不充分 延长匀浆时间 RNA沉淀溶解不充分 65℃加热可促进溶解 A260/A2801.65 匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小 增加RNA抽提试剂用量 匀浆后，样本没有静置 室温静置5分钟，促进裂解反应 水相中可能有酚残留 吸取上清时应注意操作的正确性 RNA沉淀溶解不充分 加热可促进溶解 测比值时，RNA溶解在DEPC水中，低的离子浓度和PH值增加了280nm的吸光值 比值时，采用TE溶液溶解RNA RNA降解 取样操作不正确 取样后应立即抽提和冻存 样本保存不当 －80℃或液氮保存 液相中可能有RNA酶污染 采用RNA抑制剂 制胶时所用甲醛的PH值小于3.5 试剂新鲜配制 DNA污染 匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小 增加抽提液用量 蛋白、多糖污染 抽提时蛋白和多糖去除不彻底 RNA沉淀时，加入部分盐溶液，选择性沉淀RNA 三、确定RNA质量的常用方法 1） 检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。当R1.82时，说明RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2的）。当R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定要不要使用这份RNA（不同的实验对RNA质量的要求不同）。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。 2） RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的。但如果仅仅是为了检测RNA的质量，没有必要进行如此麻烦的实验，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。 3） 保温试验：确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中，用pH7.0的Tris缓冲液补充到10μl的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中，保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。 四、RNA酶活性的控制 为了获得高质量的真核细胞mRNA， 必须使用RNA酶抑制剂或采用破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。 实验过程中，由于操作不慎，外源性RNA酶可以通过下述途径污染RNA：（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽： 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次， 并于100℃干烤15分钟（Kumar和Lindberg,1972）。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸气灭菌15分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制