人IgA-抗组织转谷氨酰胺酶抗体(IgA-tTG)酶联免疫分析.doc

人IgA-抗组织转谷氨酰胺酶抗体(IgA-tTG)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号：CSB-E11907h 特异性：本试剂盒可同时检测IgA-tTG，且与其他无交叉反应。 有效期：6个月 预期应用：ELISA法定量测定血清、血浆或其它相关生物液体中IgA-tTG含量。 说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 实验原理 包被，制成固相载体IgA-tTG抗体进行反应，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IgA-tTG呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品IgA-tTG的效价（抗血清最终能显色的最高稀释倍数记为效价）。 试剂盒组成及试剂配制 酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。 辣根过氧化物酶标记IgA抗体稀释液?（HRP-IgA Diluent）：1×10ml/瓶。 辣根过氧化物酶标记IgA抗体（HRP-IgA）：1×120μl/瓶（1：100） 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 需要而未提供的试剂和器材 标准规格酶标仪 高速离心机 电热恒温培养箱 干净的试管和Eppendof管 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6. 蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存 血清：全血标本请于室温放置2小时或过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算，稀释了“N”倍，标本“N”。 辣根过氧化物酶标记IgA抗体的稀释原则： 临用前以辣根过氧化物酶标记IgA抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记IgA抗体加990μl辣根过氧化物酶标记IgA抗体稀释液?的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 操作步骤 实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。 加样：分别设空白孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔加待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加辣根过氧化物酶标记IgA抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃60分钟。 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，50μl/每孔，甩干。 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见孔有明显蓝色，即可终止）。 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。 注： 1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。 2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。 3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。 4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。辣根过氧化物酶标记IgA抗体工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的辣根过