人凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)酶联免疫分析.doc

人凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号：CSB-E08431h 检测范围： ng/ml - 20 ng/ml 最低检测限： ng/ml 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的TAT，且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期：6个月 预期应用：ELISA法定量测定血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中TAT含量。 说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗TAT抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗TAT抗体、HRP标记的，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TAT呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。 标准品（Standard）：2瓶(冻干品)。 样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液?（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100） 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100） 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 需要而未提供的试剂和器材 标准规格酶标仪 高速离心机 电热恒温培养箱 干净的试管和Eppendof管 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6. 蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2 - 8°C 1000 g离心15分钟，或-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。 标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为0 ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释0 ng/ml， ng/ml， 5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.2 ng/ml， ng/ml， ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。 如配制0 ng/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）0 ng/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 生物素标记抗体的稀释原则： 临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则： 临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液?的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 操作步骤 实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有