单细胞pcr基因表达分析是需要了解干细胞的异质性.docVIP

单细胞基因表达分析是需要了解干细胞的异质性。 Date Published:?5/29/2014,?Issue 87;?doi:?10.3791/51408 Keywords:?Molecular Biology,?Issue 87,?Single cell,?heterogeneity,?Amplification,?qRT-PCR,?Reverse transcriptase,?human Embryonic Stem cell,?FACS 大多数高等真核生物的人群是异质从而汇集与人口分析，它往往是难以解释其细胞的功能。在一个人口单个细胞可能是细微的差别，而这些差别能有重要影响整个人群1，2的特性和功能。特别是，人胚胎干细胞（胚胎干细胞）被称为是异质的，这会导致不同程度的多能性和多样化的电位，以微妙独特的方式3，4谱系规范。例如，不同的细胞表面抗原，可用于分类的未分化的多能干细胞，5和奥斯汀史密斯组建议在小鼠胚胎干细胞不同级别的多能性，根据其形态，分化倾向和信号转导通路6的依赖性。这种现象被推测在人类胚胎NIC干细胞7。而整体的研究，不同的干细胞系，而不是单个单个干细胞中进行的，它可能是非常有趣的，分析不同层次的多能性的在单细胞水平，这可能会影响其分化能力，向全体细胞谱系。 细胞和分子异质性可以通过转录分析来决定的，这就是所谓的“单细胞转录组”，并强调定量基因表达水平8-10新方法。用于在单个细胞的基因表达水平的分析，我们开发了单细胞定量RT-PCR的一个简单的，但健壮的协议。我们证实了我们的协议的有效性和可行性通过比较单个细胞裂解物各一半以及人类胚胎干细胞的连续稀释的总RNA，产生最小的技术的变化和差异。进一步，我们使用了遗传记者线隔离同质population利用基因打靶系统的人类胚胎干细胞。用于靶向OCT4基因座（OCT4-2A-EGFP-PGK-迪普 ??罗构造）和一对TALEN质粒的供体载体被用来11。供体载体和一对TALEN质粒导入人类胚胎干细胞（H9，WA09）使用我们的核转染和克隆选择协议和维护人类胚胎干细胞是基于我们的日常协议12进行的。我们证实了这OCT4基因记者一行表达绿色荧光蛋白的表达OCT4?:: EGFP的胚胎干细胞。 我们的结果表明，个体的胚胎干细胞（排序OCT4 :: EGFP强阳性细胞）保持高水平的OCT4的表达，但不同层次的NANOG的表达。所以，我们的单细胞基因表达分析应该对学习多能干细胞的人口异质性是有用的。 一个96孔板的1。下游 混合1μL单细胞DNase1至9微升单细胞裂解液。 把10μl的混合溶液中的96孔PCR板各孔中。 2，拆卸人类胚胎干细胞的分离纯化流式细胞仪 从60毫米培养皿用1ml的Accutase 20分钟，在37℃，这是中和人ES介质分离OCT4 :: EGFP的胚胎干细胞系。 制备的细胞群体在1ml的FACS缓冲液和细胞调整至1×10?6细胞/ ml。 通过一个35微米的细胞过滤帽筒通过细胞样本。 细胞分选之前存储管冰。 的FACS纯化的单细胞在96孔平板的每个孔3。裂解 排序的样品用于在细胞分选器与受过训练的操作者的EGFP阳性细胞。把单细胞成单细胞Lysis/DNase1解决方案在96孔PCR板。如果有必要，96孔板与样本可以被存储在一个-80℃的冰柜少于一个月。 孵育样品5分钟，在室温下细胞裂解。 加入1μl终止液终止反应溶解。 孵育2分钟，在室温。 4，反转录 添加到20μm的SMA-T15，SMA-A中的每个0.5微升等分。 加4μl的5X缓冲液，2微升DTT，1μl的逆转录酶，和1μl的dNTP各孔中。 在热循环仪中进行反转录。 在42℃下将热节目×90分钟，灭活逆转录酶在85℃×5分钟。 5，扩增 加入4微升ExoSAP-IT试剂到每个反转录样品。 孵育的样品在37℃下15分钟，80℃15分钟以灭活ExoSAP-IT试剂。 准备PCR反应混合物瓦特第i个SMA-P2（2纳米） 加入10μlPCR反应混合物中各逆转录样品。 进行放大，由20个循环（94℃，30秒），退火（57℃，30秒），延伸（68℃，10分钟）。 6，实时定量RT-PCR检测性能 加10μl的2倍的SYBR Green PCR主要混合液，1微升扩增的cDNA，2 nM的引物，和7微升水的每个孔中。 设置程序随后95℃3秒，60℃30秒×40个循环。 执行一式两份的技术错误。 高效率和强大的单细胞RNA扩增 为了尽量减少人类胚胎干细胞中的转录变化，我们使用的OCT4 :: EGFP的胚胎干细胞克隆流式细胞仪净化。OCT4 :: EGFP阳性细胞分选入96孔板后，每个小区被裂解在裂解缓冲液中，并用SMA-T15（GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT）引物和具