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单细胞凝胶电泳检测技术 摘要： 单细胞凝胶电泳技术又称彗星实验，是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法，具有快速、简便、价廉的优点。近年来越来越多的应用于遗传毒理学、生物和环境检测、肿瘤学的研究，本文就这些方面进行了综述。 关键词： 单细胞 电泳 DNA损伤与修复 单细胞凝胶电泳（single cell electrophoresis assay, SCGE）又称彗星试验（comet assay）,是一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法，由Ostling等于1984年首次提出，并利用该技术在中性条件下检测γ射线引起的DNA双链断裂。1988年Singh等建立了碱性单细胞凝胶电泳技术。1997年，Santos等首次将SCGE技术与DNA荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)结合起来，为SCGE技术的应用开辟了新的途径。2001年， Nadin等建立了SCGE银染法，进一步提高了损伤DNA分析的灵敏度[1]。 SCGE 技术原理及方法 1．1 原理 在中性条件下，DNA双链不打开，只有DNA双链断裂时，才有DNA断片进入凝胶中迁移；在强碱条件下，DNA双链被打开，释放出断裂的DNA片段，电泳时，带负电荷的DNA移向正极，形成“彗星”状影像，DNA损伤越多，进入尾部的DNA碎片越多。尾长在辐射高剂量时达到饱和不再增加，而尾矩则与辐射量呈线性相关。因此，在尾长、密度、面积、尾矩等各项分析指标中，尾矩能更精确地测定DNA损伤。[2] 1．2 实验方法 首先制备细胞悬液，并用PBS调整细胞浓度为106~107个/ml，细胞溶解后再进行DNA损伤的诱导处理。 1．2．1 制片 有3种类型: (1) “三明治”凝胶,第1层为100~110μl 10.5%的NMA,第2层为合细胞悬液的LMP75μl,第3层仍为LMP75μl。 (2)双层凝胶,即不铺第3层胶; (3)单层凝胶,为改善其易与玻片分离的特点,可在玻片上制一凹槽进行单层灌胶[3]。经实验发现，一层胶法的效果不好，胶太薄容易漂浮；三层胶虽然解决了脱落漂浮的问题，但会影响观察的效果；而二层胶法既能使胶面较好的附着，又能使细胞尽可能多的处于同一平面，染色效果更好[4] 1．2．2 细胞裂解 目的是去除细胞浆，只留核中的DNA，裂解时间多为1小时。为了避免脱胶，裂解液在使用前需预冷，同时裂解液中要加入1%DMSO为减少裂解中自由基对DNA的额外损伤。在有的实验中还需要加入蛋白酶K，以清除蛋白质残基，避免DNA修复酶的作用[5] 1．2．3 解旋 裂解后在碱性溶液（1 m mol/L Na2EDTA,300 m mol/L NAOH p H13）中使DNA双链打开，时间约为20~60分钟。 1．2．4 电泳 一般在低电压（0.5~5V/cm）和短时间（20~30min）内进行。电压过高或电泳时间过长，彗星细胞拖尾以致彗星消失，而非彗星细胞也会泳出尾部形成假阳性结果；反之，电压过低或时间过短，DNA断片不易泳出，受损细胞无拖尾而造成假阴性结果[5] 1．2．5 阅片 在玻片上滴加溴乙锭、DAPI（根据实验的不同，采用不同的浓度）等，加盖盖玻片，即可在荧光显微镜下观察。 上述过程均应在黄光或暗室中操作，避免引起额外的DNA损伤。 1．2．6 实验结果分析 在荧光显微镜下放大200倍或400倍进行图象观察，观察指标有尾长即DNA迁移的长度，在低损伤剂量范围内与DNA损伤呈线性关系；尾矩即尾长与尾部DNA百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾惯量是与每个尾块的面积、平均荧光强度、在X轴上与彗星中心距离有关的综合性指标。彗星图象分析方法有：目镜测微尺直接测量，显微照相后用两脚规测量，经图象分析仪进行分析，或借助专门的图象分析软件如Lucia、Auto Gentox等彗星图象分析软件进行分析[6] 2． SCGE研究的类型 用于SCGE的生物种类很多，哺乳类有人、大鼠、小鼠、兔等；非哺乳类有鲫鱼、泥鳅、蚯蚓等。植物类的烟草；谷康定等还将此技术应用到真核单细胞微生物（四膜虫），且认为从方法上完全可以与动物原代和传代细胞互相替代[7]。细胞类型主要包括外周血淋巴细胞、肝细胞、脾细胞、胸腺细胞、骨髓细胞、肺泡细胞、鼻黏膜细胞、肿瘤细胞、睾丸细胞、神经细胞、精子及培养细胞、植物细胞等[8]。 用于SCAG的研究因子大致可分为3类，物理因素包括各种放射性元素、射线、冰冻、光照等；化学因素包括重金属及其化合物、过氧化物、臭氧、石棉、有机致癌物、有机染料、麻醉剂、抗癌药物、抗真菌剂等；生物因素包括细胞类型、细胞生长周期、细胞的D