差异表达基因克隆技术的研究进展.docVIP

差异表达基因克隆技术的研究进展 　 提要： 分离并克隆差异表达基因是目前功能性基因研究的热点。mRNA差异展示是筛选差异表达基因最有效的技术之一，它的主要不足是有一定假阳性。RDA、SSH、DSD、LSH技术能够克服假阳性，但也具有一定的不足，应根据需要选择运用。随着能扩增长片段及具有自动校正功能的Taq酶出现及应用，这些技术将会不断完善与发展，具有广阔的应用前景。 关键词： 差异表达基因；克隆 “一石激起千重浪”，用来形容“多莉”绵羊的问世在人们心中的各种反应真是一点都不过分，在生物技术和医学技术的发展过程中，无论是试管婴儿、人工授精，还是体外授精、代理母亲等一系列生殖技术的成果在世界上引起的反应，也许都稍逊于“克隆”。试管婴儿也好，体外授精也好，代理母亲也好，生命的产生毕竟还是基于精子和卵子的结合，这是人们可以堪慰的；而“多莉”是通过“无性繁殖”技术获得的，这种在低级生物中相当普遍、而在高等动物中只是幻想的“无性繁殖”瞬间就摆在了人们眼前。 现代分子生物学研究表明，人类基因组约由10万左右的不同基因组成，这些基因选择性的表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。因此，分离并克隆差异表达基因不仅有助于阐明生命的粤秘，而且还能为基因诊断与治疗提供重要的理论依据。近几年来，差异表达基因克隆技术不断完善与发展，已成为研究肿瘤和疾病等相关基因的重要手段。 高等真核生物的基因组一般具有80?000～100?000个基因，而每一个细胞大约只表达其中的15%［1］。基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的提供了依据。 一、mRNA差异展示 mRNA差异展示（mRNA differential display,DDRT-PCR）是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一，其基本原理是：3′端采用锚定引物，与mRNA3′poly a结合，进行反转录，形成mRNA：cDNA杂交分子，5′端采用20条随机引物，与锚定引物一起进行PCR扩增，其产物经测序胶显示出来，再回收鉴定克隆差异条带。1992年Liang和Pardee[1]建立此技术时，5′端采用20条随机引物，每条由10个碱基组成，3′端采用12条引物即T12MN(M=A、C或G，N=A、G、C、T)。这种组合从统计学上几乎能完全覆盖所有的mRNA序列，差异表达的基因会全部呈现出来。实践证明，这种方法有效，但假阳性率在50%～70%左右，差异条带在Northern印迹上重现性差，后续处理也比较复杂。1994年Ito[2]等对3′端引物进行了改进，把12条引物改为3条，即T12A、T12C、T12G，使得实验操作简化。1995年Ayala[3]等提出了在3′端锚定引物与5′端随机引物上皆增加10个碱基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR循环参数也改为前5个循环采用Liang和Pardee推荐的参数，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。经这样改进，显著地增强了差异条带的重复性和敏感性，同时使得差异条逼带的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]对5′端此物进行了改进，引物条数改为8条，皆带上HindⅢ酶切位点，每条由13个碱基组成，3′端锚定引物采用3条，也带上HindⅢ酶切位点，每条由18个碱基组成，PCR循环条件仍采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40个循环，最后在72℃延伸7min。1998年[5]我们在Liang和Pardee改进的基础上，对PCR循环参数进行了改进，即前5个循环采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,后35个循环采用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最后在72℃延伸7min。经这样改进，既保持了扩增效率，又增强了差异条带的特异性及重复性，降低了假阳性率。 mRNA差异展示具有简便、快速、所需起始材料少、同时可在多个材料之间或不同处理材料之间进行比较等优点，但具有较高频率的假阳性和短小的差异片段的缺点，给后续处理带来一系列问题，虽然此技术经过了一些起改进，但这两个缺点仍限制着此方法的充分应用。 二、代表性差示分析 代表性差示分析（representational difference analysis,RDA）最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]将其应用于克隆差异表达基因，其基本原理是：靶方（Tester,T）和驱动方（Driver,D）的cDNA在进行差方式分析前均用一种识别4碱基序列的限制酶作切割处理，形成平均长度为256bp的cDNA片段代