B-RAF基因及MAPK信号转导通路和胃癌相关性及其机制的研究.pdf

·中文论著摘要· B-RAF基因及MAPK信号转导通路和 胃癌相关性及其机制的研究 前 言 对肿瘤(癌)发生机制和防治的研究，多年来一直是人们关注和研究的热点 问题。肿瘤的发生和侵袭转移是涉及许多基因参与的、多途经和多步骤的发展过 程。其中，癌基因控制机体细胞的生长和分化，重要的癌基因激活可引起肿瘤的 发生。 癌基因B-RAF属于RAF基因家族，编码丝氨酸，苏氨酸激酶，是有丝分裂原 激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)信号转导通路中的重要成 员之一。近年来的研究发现许多肿瘤中存在B-RAF基因突变，尤其是黑色素瘤和 甲状腺癌中良刚F基因突变率高达60～80％，突变主要集中于B-RAF基因的第ll 和第15外显子，这说明B-R．4F基因与黑色素瘤和甲状腺癌有关。到目前为止国 内外有关B-RAF基因在胃癌发生、发展中的机制研究尚未见报道。 我们在前期工作中利用基因芯片技术对胃癌发病不同阶段的基因表达进行了 较为全面、动态的研究．我们发现B-RAF基因在癌旁、癌及淋巴结转移癌中表达 与正常胃粘膜组织相比均有明显升高，提示B-RAF基因可能是胃癌发生过程中的 一个重要基因。因此我们首先对150例人胃癌组织标本中B-RAF基因突变热点第 ll和第15外显子进行突变筛查，结果显示阴性；但同时的免疫组化以及Western 表达，这说明B-RAF基因与胃癌有相关性，但B-RAF基因在胃癌中的作用机制可 能不同于黑色素瘤和甲状腺癌。为了深入探讨B-RAF基因在胃癌发生、发展中的 可能作用，阐明B-RAF基因及MAPK信号转导通路和胃癌的相关性及其机制， 以及良剐F基因的上游调控基因，我们首先应用RNA干扰技术抑制胃癌BGC823 响；其次利用免疫沉淀(P)技术结合蛋白质的质谱分析研究B-KAF蛋白在胃癌 细胞中发挥作用时可能与之结合的未知蛋白；最后应用GGTI．298和FTI-277分别 抑制RAS和RAPI蛋白活性以及利用生物信息学软件预测并用染色质免疫沉淀 基因及MAPK信号转导通路与胃癌相关性以及对B-RAF基因在胃癌发生中调控机 制研究具有重要意义． 方 法 Western Lipofectamine 术、Transweli和RT-PCR以及WesternBlot分别检测B-RAF基因和Re／d基因表达 抑制后对胃癌细胞系BGC823细胞生物学特性的影响以及分子机制：免疫沉淀技 术结合蛋白质的质谱分析技术研究可能与B-RAF蛋白结合的未知蛋白；利用 GGTI-298和FTI-277处理胃癌细胞系BGC823细胞，WesternBlot检测二种抑制 荆对胃癌细胞中B-RAF基因表达的影响；利用生物信息学转录因子预测软件预测 可能与B-RAF基因上游启动子区特异序列结合的转录因子，并用染色质免疫沉淀 技术结合PCR技术对生物信息学转录因子预测软件预测的结果进行验证。 结 果 1．人胃癌组织中B-RdF基因突变筛查结果： ． 在150例人胃癌组织和癌旁组织标本中未筛查到B-R．4F基因第ll外显子和 第15外显子存在突变。 2．人胃癌组织中B-RAF蛋白表达分析： 免疫组化结果显示在20例人胃癌组织标本中，胃癌细胞中可见棕色颗粒，主 2 要分布于细胞质，B．RAF蛋白表达阳性，而正常胃腺细胞中未见棕色颗粒，B-RAF 蛋白表达阴性。 3．里翩只斑ⅢA对胃癌细胞中良RdFmRNA表达的影响： B-RAF-siRNA转染BGC823细胞第5和第7天时B*RAFmRNA表达水平可见 到明显变化，B-RAF-siRNA组较对照组B-RAFmRNA表达水平明显降低。 4良RdRsiRNA对胃癌细胞中B-RAF蛋白表达的影响： 表达受到抑制。 5．B-RAF-siRNA对人胃癌BGC823细胞生长的影响 明显抑制作用．其中，转染后72h抑制率达200,4。 6．8．R。4BsiRNA对胃癌细胞凋亡的影响 细胞凋亡。 mRNA的表达。 7．B-RAF-siRNA抑制人胃癌BGC823细胞中BCL-2 8．良RdBsiRNA对细胞侵袭力的影响 B-RA