Ca2%2b%2fcbl-b%2fAKT通路在脑缺血预处理保护机制中的作用研究.pdf

Ca2+／cb I-b／AKT通路在脑缺血预处理 保护机制中的作用研究 博士生姓名： 姜永梅 指导教师： 尹琳教授 指导小组： 姜长斌教授 专业名称： 内科学 摘要 在中国，缺血性脑血管病的发病率排名世界第一，比美国高出一倍。脑卒中已 经升为中国第一位死因，死亡率高于欧美国家的4-5倍。我国存活的脑卒中患者 中，约有3／4不同程度地丧失了劳动能力，其中重度致残者约占40％，存在偏瘫、 失语、智能低下、生活不能自理等残疾，严重影响患者的生存质量。急性脑卒中 的治疗目标为限制缺血的严重性及减少缺血持续的时间，以保存缺血半暗带的低 灌注区的面积，缺血瀑布理论为急性期的干预提供了治疗靶点。但急性期的治疗 干预效果有限，要根本解决脑血管病造成的脑损伤，就要从脑细胞对缺血应激损 伤的适应机制上千预治疗。 在本研究中，采用了大脑中动脉栓塞法制作了SD大鼠脑缺血预处理(cereb— ral ischemic 组大鼠海马神经元内Ca2+浓度的变化，检测各组大鼠海马神经元的凋亡情况。评价 了神经功能缺损评分及脑组织的梗死体积；应用Westernblotting检测Ca2+信号 B-cell lineage proteion kinasep 号传导通路在CIPC中的作用机制，及脑神经保护的机制。 目的： 1．SD大鼠实验模型制备采用的是局灶性大脑中动脉栓塞法，在本实验中探讨 了实验方法的改进，以提高实验的成功率。 2．采用TUNEL凋亡检测法检测各组大鼠海马神经元的凋亡情况，以明确经 CIPC及Ca2+调节剂干预后神经元凋亡的情况。 3．应用激光扫描共聚焦显微镜检测各组大鼠海马神经元内Ca2+浓度变化情况， 已明确CIPC及Ca2+调节剂干预后神经元内Ca2+的浓度变化。 4．评价各组大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积，以明确CIPC及各种Ca2+调 节剂对大鼠神经功能缺损及脑梗死体积的影响。 5．应用Western p-AKT的蛋白表达情况，进一步探讨凋亡相关蛋白在CIPC中的表达变化情况及如 何调整神经元的存亡。 6．采用RT—PCR技术检测海马神经元内cbl-b的转录变化情况，进一步探讨 CIPC对神经元的凋亡的干预是否是从转录水平参与调控的。 方法： 第一部分：大鼠大脑中动脉栓塞(theocclusionofcerebrMmiddle artery．MCAO) 模型制备的改进 参考Koizunfi线栓方法及焦卓敏局灶缺血模型的方法，做出以下几个方面的 调整：1)采用颈部正中偏右侧的手术切口，2)根据大鼠的体重为200．2509，选 择的线栓直径为0．26mm，3)应用统一购买的成品线栓，制备CIPC模型，脑缺血 染色判定模型制备是否成功。 第二部分：各组大鼠海马神经元内游离Ca2+及凋亡神经元的检测 1．试验动物分组雄性SD大鼠60只，随机分为假手术组、脑缺血组、CIPC 2．采用寡核苷酸末端脱氧核糖转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记法 (TUNEL)检测各组大鼠右侧海马凋亡阳性神经元。 3．各组大鼠在预定时间断头取脑后，经分离海马神经元、荧光标记、激光扫 描共聚焦显微镜检测，计算出不同组大鼠的海马神经元内游离Ca2+平均荧光像素 值，进行海马神经元游离Ca2+的检测。 1．雄性健康SD大鼠108只，随机分为假手术组、脑缺血组、CIPC组、尼莫 (环孢素A组)组共6组，每组18只。 2．采用bederson法评价各组大鼠的神经功能缺损情况及应用TTC染色进行脑 梗死体积比较。 3．各组大鼠在预定时间点断头取脑，采用RT—PCR及WesternBlot