Canstatin-N基因在E.coli和P.pastoris中表达及其活性分析.pdf

内容提要 血管基膜是血管的重要组成部分，它在血管生成过程中起着重要的作用。胶原蛋 白Ⅳ是血管基膜的主要构成成分，它由伍1、砣、0【3、仅4、a5和a6六条遗传学上不 同的仅链构成，每条a链由三个区域组成：半胱氨酸富集的N一端7S区、中部三螺旋 链的C端NCl区，它能特异地抑制血管内皮细胞增殖和迁移，在体内能抗新生血管 生成和抑制肿瘤生长。本研究克隆了人血管能抑素N端基因，实现在大肠杆菌和酵母 中表达。． bp 的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段，用髓根I和勋ZI双酶切将其克隆进 诱导下，人血管能抑素N端基因片段获得了高效表达，主要以包涵体形式存在。在 摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响，结果表明 琼脂糖凝胶FF亲和柱层析对重组蛋白进行了初步的纯化研究。抗血清经去除其中的 交叉反应抗体后进行W．estem blotting分析。结果显示兔抗人血管能抑素抗血清能特异 地与人血管能抑素N端起抗原抗体反应。在C』蝴试验中人血管能抑素N端片段抑制 鸡胚绒毛尿囊膜(C舢岫新生血管的形成。 达载体pPIC9ⅪC．CN，用勋ZI线性化重组质粒后，用电激法将重组载体转化毕赤酵 得多拷贝重组菌株。重组菌株在甲醇诱导下表达目的蛋白。SDS．PAGE分析结果显示， 应抗体后进行WeStem blotting分析。结果显示兔抗人血管能抑素抗血清能特异地与人 血管能抑素N端起抗原抗体反应。经过初步纯化，将目的蛋白进行CAM血管生成抑 制活性分析，C√～M试验证明在只p甜幻，．捃胞内表达的Can蚴in-N重组人血管能抑素 能抑制CAM血管生成。只p傩幻，．括中表达产物的活性较EcD厅中表达的好。 综上所述，本研究克隆了人血管能抑素N端基因，实现在大肠杆菌和酵母中表达。 证明了人血管能抑素N端具有生物活性，人血管能抑素N端在体内有抑制鸡胚绒毛 尿囊膜(CAM)新生血管形成。尸胛研括中表达产物的活性较EcD以中表达的好。为寻 找高效的新的血管生成抑制因子和抗癌蛋白打下了良好基础。 主题词：Callstatin-N毕赤酵母大肠杆菌基因表达 活性分析 Abstract V船clll打b觞ement stll尬tural ofblood me瑚【brane，animponj眦t conlponemVessels， an in a ofV嬲cul盯 playsinlpor觚roleaIl百ogenesis．TypeⅣcoUagen，m萄orco瑚【poIlem baSement ofsiX meIIlb啪e，collsists genetically a—chaillis nlree of domaills，a 科(Ⅳ)，旺5(IV)aIld0【6(IV)．Eachc0脚【posed cysteine—riCh N-蛐al7S central domaillaIlda C—terrllinal domain，a 仃iple—helical globular domaillof也e伐2cllaillof NCl typeⅣ non—collagenouS(NC1)domaill．C趾