Cbl-b介导FLIPL的降解调控三氧化二砷诱导肿瘤细胞自噬的机制研究.pdf

·中文论著摘要· Cbl．b介导FLIPL的降解 调控三氧化二砷诱导肿瘤细胞自噬的机制研究 目 的 在过去的20多年里，三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)被成功的用于多 种血液恶性肿瘤疾病的治疗，最近的临床试验证实，在其他实体肿瘤中，ATO也 显示了很好的临床应用前景。其多种作用机制被广泛的探讨，例如刺激细胞分化、 诱导细胞凋亡等，近年来越来越多的证据表明，自噬在调控肿瘤细胞存活的过程 中发挥着重要作用。自噬可能扮演着双面角色，既能诱导细胞对放化疗抵抗，又 能导致自噬性死亡，这可能与肿瘤细胞的类型，肿瘤发生的不同阶段，药物作用 的不同信号通路密切相关。目前文献表明，ATO在诱导凋亡的同时能明显的诱导 肿瘤细胞自噬的发生，然而，具体的信号机制尚不明确，值得进一步研究。 deathdomain—likeinterleukin—l c．FLIP(cellularFas—associated B·converting enzyme 肿瘤组织中表达，在蛋白水平上主要有2种形式，包括长片段的FLIPL、短片段 的FLIPs。目前大多数文献报道FLIPL在调控死亡受体介导的细胞凋亡过程中发挥 主要的生物学功能，该基因通过与caspase．8竞争性结合从而阻断凋亡通路的转导。 B转录活性，下调FLIP表达，促进肿瘤细胞 最近研究表明，ATO通过抑制NF．K 发生凋亡。然而，FLIP是否参与ATO诱导的肿瘤细胞自噬调控未见报道。 Cbl(CasitaS Lymphoma)家族蛋白，作为E3泛素连接酶，在调控 B．1ineage 泛素化底物蛋A的降解进而影响细胞功能方面发挥着重要作用，国内外研究证实 Cbl蛋白能与多种受体／非受体酪氨酸激酶底物结合，诱导其泛素化降解，我们既 诱导的细胞自噬尚不清楚。 为深入阐述ATO诱导自噬的作用机制，本研究以慢性粒细胞自血病细胞系 程中的作用，进一步以胃癌细胞系MGC803为模型，通过RNA干扰技术，探讨 ATO诱导肿瘤细胞自噬的信号调控机制。 材料与方法 1、采用台盼蓝拒染法或M兀法测定细胞活力。 2、采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞凋亡判定。 3、采用Westemblot检测蛋白表达。 4、免疫共沉降检测蛋白间的共结合。 5、透射电子显微镜检测自噬体形成。 2000试剂进行稳定转染和瞬时转染。 6、采用Lipofectamine 软件进行t检验。P0．05有统计学意义。 结 果 一、ATo诱导多种肿瘤细胞发生凋亡和自噬 增殖。24小时的抑制细胞增殖50％的药物浓度(IC50)分别是4．59M．53lxM、 5．92士1．39 laM、49．76士8．34肛M矛口59．33士7．90pM。 时和24小时，Westernblot显示凋亡相关蛋白PARP发生裂解，白噬相关蛋白 nnl之间。 察到在细胞胞浆中大量的自噬体形成，直径在300．900 抑制剂氯喹(CQ)(20pM)明显增强ATO诱导的细胞增殖抑制和凋亡。 二、FLIPL参与调控ATo诱导的自噬 blot 2 检测结果显示跣潆：L水平戳时闽依羧方式下调。 siRNA于抗投术，MGC803绑胞转染FLIPL．siRNA48，l、时厝，Western blot检测 结果显示转染酶MGC803细骢发生PARP裂瓣鞠LC3。l薹水平增加。