C-肽对大鼠肾小球系膜细胞NF-κB-iNOS途径调控的初探.pdf

中文摘要 摘 要 目的：糖尿病肾病(Diabetic 严重性仅次于心血管并发症。DN的早期表现为肾小球系膜增生，基膜增 厚，细胞外基质积聚，最终导致肾小球硬化。系膜细胞是肾小球内产生细 胞外基质的主要固有细胞，通过其自身代谢和功能改变直接影响DN进 程。目前DN发病内在机理尚未阐明，但已公认其发生、发展的中心环节 是氧化应激。 本课题组前期研究结果显示，在DM大鼠肾脏组织中氧化应激反应 nitricoxide 关键酶一诱导型一氧化氮合酶(inducible mRNA和蛋白表达水平明显上调，iNOS活性显著增高，其合成的一氧化 氮(nitric 衍生物的氧化能力较H202强约2000倍，可造成严重氧化应激损伤。 已知核转录因子NF．rd3(nuclear B，NF．1出)是iNOS基 factor-kappa 和Rel．B五个成员。它们通常以同源或异源二聚体形式存在，其中以p50． B (Inhibitorykappaprotein，I避)以非活性状态的三聚体形式存在于细胞浆 中。作为一种快反应转录因子，被激活的NF．KB与IKB解离后入核，结 合顺式作用元件，调控下游基因转录。 C．肽是胰岛素原分子中连接胰岛素A链与B链的连接肽。人C．肽由31 脏代谢。正常人血浆C．肽基础水平约为0．4 nmol／L。最初，C．肽被认为是 胰岛素合成过程中的副产物，一种无生物活性的“生物垃圾”。随后，C肽 被发现在胰岛素原分子中对胰岛素原分子的折叠、二硫键的正确配对等分 中文摘要 子结构的形成起重要作用，但血液中游离C．肽的生理功能却一直不清楚。 近年临床应用和基础研究均发现，C．肽防治DN疗效独特，接近生理浓度 的C．肽可部分恢复受损的肾小球功能，抑制细胞外基质增生，明显改善肾 小球超微结构，逆转其纤维化。到目前为止，除C．肽外，尚无其它任何药 物或治疗方法可有效逆转DN。虽然C．肽有此功能，但作用机制未明，亟 待研究。 鉴于C．肽能有效逆转DN，而氧化应激已被证明是DN发生的中心环 节，氧化应激反应关键酶iNOS主要受到NF．1CB调控，我们推测：C．肽通过 调控NF．f13一iNOS途径，达到逆转DN的功效。 肾小球系膜细胞，给予不同浓度的C．肽、作用不同时间后，C．肽在细胞中 的功能定位如何；不同C．肽浓度、不同作用时间对细胞中iNOS的表达水 平有何影响；高糖处理系膜细胞对其NF．1cB的核转位有何影响；一定浓度 C．肽作用系膜细胞后，NF．心的核转位有何变化，未见报道。 本实验采用大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1，应用高糖模拟糖尿病高 糖状态，应用不同浓度C．肽、作用不同时间进行实验。以免疫荧光染色 表达水平的变化，来测定C．肽的有效浓度和起效时间；用免疫荧光染色 机制奠定实验基础。 方法： l细胞培养 培养箱中进行细胞培养和传代。 2实验设计与分组 换成C．肽．高糖DMEM培养。 中文摘要 2．1探讨治疗组HBZY-1细胞，同一时间点，不同浓度C．肽在细胞内定位 情况。 5组：2、3、4、5、69mol／L。 2．2探讨正常组、防治组和治疗组HBZY．1细胞，同一浓度，不同时间点 C．肽在细胞内定位情况。 正常组、防治组和治疗组细胞，均加入C．肽浓度5pmol／L的高糖 120min。治疗组作用时间分为：0、5、10、20、40、60min。 2．3探讨高糖对I--IBZY-1细胞中iNOS表达水平的影响。 组：正常对照、高糖O．5、1、1．5、2、2．5、3、3．5、4、4．5、5h。 2．4探讨C．肽对HBZY-1细胞中iNOS表达水平的影响。 C．肽．高糖DMEM作用防治组细胞4h，根据C．肽浓度不同分为8组： 正常对照、C．肽．高糖0、500、50、5、l、O．5、0．1nmol／L。 C。肽．高糖DMEM作用治疗组细胞