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新基因克隆技术进展 文章来源： 2006-7-19 13:52:49 新基因克隆技术进展 国外医学分子生物学分册 1999 年第21 卷第 3 期 晋康新 李 晴综述 徐德胜审阅 摘要 新基因克隆是当今生物学最热点的领域之一。本文从技术原理、适应性及使用例证等方面，综述 和评价了已有的及发展中的新基因克隆技术，包括克隆已有多肽分子的基因、同源家族基因克隆、功能性筛 选、差异及减数筛选等，并着重介绍了 RDA、EDS、RLCS 等差异筛选技术。 关键词 新基因；克隆 分子遗传学在理论上的重大突破，以及 70年代后限制性内切酶的发现，质粒作为载体的应用，共同推动 了 DNA 体外重组技术的发展，使分子的基因克隆成为可能。迄今，这项技术已不断地发展完善，不仅能用来 克隆已知分子的基因，而且成功克隆了一些未知分子，从而大大推动了分子水平的研究。本文以阐述基本原 理为主，介绍目前用于克隆新分子基因的方法及其应用等。 1 克隆已有多肽分子的基因 在已获得纯净多肽分子的条件下，可采用多肽序列指导引物合成的方法，用 PCR 技术以靶细胞特异 mRNA 为模板合成相应 cDNA。或者在拥有足量多肽的情况下，制备抗该多肽的抗体，并以此从表达性文库中筛选阳 性克隆。其基本原理阐述如下。 1.1 多肽氨基末端序列指导 PCR 引物合成法 对高度纯化后的多肽分子作N-端氨基酸序列分析。根据氨基酸序列反推出这部分相应的基因序列，并据 此指导mRNA5′端的引物合成。同ZAP等表达性载体构建的细菌表达性文库。同时，依据mRNA3′端poly-A(多 聚腺苷酸)序列指导合成poly-T(多聚胸腺苷酸)的3′端引物。继而，用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞 浆内溶物中合成出相应的cDNA。依据设计引物时引入的酶切位点，将该cDNA克隆到可表达性载体中进行产物 表达[1]。这一方法较适用于难于获得足量多肽、并可用特殊技术得到微量纯品的分子。 1.2 多肽特异性抗体筛选表达性文库法 该技术路线首先用拥有的多肽分子制备出特异性抗体（多克隆或单克隆抗体）。依据抗原抗体特异结合 反应，用标记了示踪物的抗体从相应表达性文库中筛出阳性克隆。早先，这项技术多用 λgtll,λZAP 等表达 性载体构建的细菌表达性文库。将印有细菌裂解碎片的膜浸于含抗体的溶液中孵育,最后以放射自显影或组织 化学得到阳性克隆。这种细菌文库筛选法局限于免疫原性蛋白质的筛选。后来，随着哺乳动物细胞表达性文 库的建立，使本方法的应用推广到细胞内活性肽、表面抗原及受体分子的克隆。 2 克隆已知序列基因家族新成员 哺乳动物细胞在进化过程中，产生出许多具有高度同源性的基因，称之为基因家族。利用家族成员基因 同源性很强的特点，可发现并得到新分子的基因。 2.1 同源探针筛选法 用已知分子的高保守序列指导同源探针制备，以此探针从相应文库中筛选出阳性克隆。为确保所得的新 基因，还必须进一步通过核酸序列分析或其它手段鉴定[12]。在缺乏全同源探针的情况下，可用其它种属的相 关基因指导制备探针。用这种部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。该法往往需要摸索 核酸杂交技术条件，以降低背景杂交干扰。 2.2 PCR放大建库法 分别用已知基因的 5′端和 3′端的高保守序列指导合成PCR引物。以此引物从靶细胞中PCR扩增出含引物 序列的所有cDNA。并将其建成 3′到5′端都含已知基因同源序列的cDNA文库。以此文库逐个进行酶谱分析。 [2] 在确认存在酶谱差异的情况下，进一步进行新基因鉴定 。 3 克隆已知生物活性的新分子（功能性筛选） 基于真核细胞可使源于真核生物的基因表达出具有生物活性多肽的特点，用其所建的表达性文库可直接 用于多肽生物活性的克隆筛选。 80 年代中期发展起来的真核表达系统，首先是将由 mRNA 制备的cDNA 克隆到穿梭质粒