生物工业分析 教学课件 作者 罗建成 主编 李晓华 主审 第八章.ppt

尚辅网 尚辅网 尚辅网 高效液相色谱分析 　　二、葡萄酒中有机酸的定性、定量分析 　　1. 标准溶液的配制 根据参考数据，葡萄酒中含：酒石酸5～10g/L、L-苹果酸2～4g/L、L-乳酸0～2.5g/L、琥珀酸0.5～1.5g/L、柠檬酸1g/L左右、乙酸＜1g/L。配置以下浓度（见下表8-3）的混合标准酸液,定容至10ml，作为寻找标准酸的色谱分离条件使用。 ? 酒石酸 L-苹果酸 L-乳酸 琥珀酸 柠檬酸 乙酸 浓度 5 5 2 1 2 1 表 8-3　标准混合酸液的配制 （g/L） 尚辅网 高效液相色谱分析 　　2. 流动相的配制 配置pH=2.5高氯酸液作为流动相。 　　3．色谱系统配有210nm波长紫外检测器；色谱柱为SCR-101H（300mm×7.9mm）；流速为 0.6ml/min；柱温 55℃；分别进样量10μl。 　　4．测定 　　（1） 定性用各种有机酸标准液分别进样,记录保留时间。 　　（2）定量用峰面积外标法，将不同浓度酸液从低浓度到高浓度依次进样，计算各自的峰面积（每个样平行进3次），作各种有机酸的标准曲线（峰面积-浓度）。 * * 尚辅网 生物工业分析 第八章　高效液相色谱分析 第一节　基本原理 第二节　液相色谱操作 第三节　应用实例 尚辅网 高效液相色谱分析 第一节　基本原理 　　一、液相色谱过程 　　1．流程图 高效液相色谱的流程如图8-1所示。高压泵输送流动相和试样组分高速流过色谱分离柱时，具有不同分配系数的组分在两相间经过反复多次的分配平衡时被分离，通过检测器时被检测并给出信号。 尚辅网 高效液相色谱分析 　　高压输液泵 　　高压泵是高效液相色谱的动力源，用来使液体流动相高速通过色谱分离柱以达到快速分析的目的。在高效液相色谱中，通常使用往复式柱塞泵，结构如图8－2所示。 尚辅网 高效液相色谱分析 　　梯度淋洗装置 　　梯度淋洗就是流动相中含有两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，使被分离组分在两相中的分配系数改变，达到提高分离效果，调节出峰时间的目的。两种方式来实现：外梯度（也称低压梯度）和内梯度（也称高压梯度），外梯度是在常压下，按一定程序将溶剂混合后再通过高压泵输入色谱柱；内梯度是利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 　　进样装置 　高效液相色谱是在很高的压力状态下工作的，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图8－3所示。 尚辅网 高效液相色谱分析 　　高效分离柱 　高效液相色谱的分离柱具有很高的柱效，理论塔板数达每米3万。柱体为直型不锈钢管，内径l～6nm，柱长5～40cm。液相色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效，因此柱较短。 尚辅网 高效液相色谱分析 　　高效液相色谱检测器 　　紫外光度检测器 　　最小检测量可达10-9g·mL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。其原理是基于试样中各组分对特定波长的紫外光有选择性吸收，组分浓度与吸光度之间服从朗伯-比耳定律，因此要求在测定波长处，流动相应无明显的吸收，而被测组分应有较大的吸光系数。紫外光度检测器有固定波长和可变波长两种，前者的测定波长固定（254nm或280nm），适用于芳烃化合物的检测。后者可根据试样选择测定波长，方便灵活适用面广。紫外光度检测器的光路图如图8-4所示。 尚辅网 高效液相色谱分析 　　光电二极管阵列检测器，由211个（或更多）二极管组成阵列，各检测特定波长，将吸收后透过的紫外光束分光投射到二极管阵列上，用计算机快速处理，可获更多信息及显示吸光度、波长、时间三维立体谱图，如图8-5所示。 尚辅网 高效液相色谱分析 　　差示折光检测器 　　差示折光检测器的最低检测量达10-7g·mL-1，对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。其原理是基于含有被测组分的流动相和纯流动相的溶液折射率之差与被测组分在流动相中的浓度有关，可根据流动相折射率的变化，测定试样组份含量。 　　高效液相色谱法还可利用其高效分离的特点，将柱后流出组分分别收集，蒸去流动相，获得难于通过一般方法制备的高纯度样品（色谱纯）。 　　液相色谱制造技术要求高，仪器价格、操作、维护费用也相对较高，故远没有气相色谱的普及程度高。 尚辅网 高效液相色谱分析 　　2．高效液相色谱法的主要分离类型 （1）吸附色谱（液--固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。分离原理是组分在两相间经过反复多次的吸附与解吸分配平衡。 　（2）分配色谱（液--液分配色谱）：早期通过在担体上徐渍一薄层固定液制备固定相，与流