生物物质分离工程（ 第二版） 教学课件 作者 严希康 主编 第20章重组蛋白包含体体外复性.pptVIP

尚辅网 尚辅网 尚辅网 包含体蛋白复性的理论基础 2 包含体蛋白的体外复性 3 包含体的形成及一般特性 1 20 重组蛋白包含体体外复性 蛋白质结构研究技术 4 尚辅网 20.1 包含体的形成及一般特性 1 2 包含体的形成 包含体的特性 尚辅网 20.1.1 包含体的形成 ①表达量过高。 ②重组蛋白的氨基酸组成。 ③重组蛋白所处的环境。 ④重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白。 ⑤在细菌表达蛋白过程中，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包含体的形成。 尚辅网 20.1.2 包含体的特性 （１）包含体的结构特征。 （２）包含体的生产优势。 包含体表达的有利因素包括： ①可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包含体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解； ②降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高； ③包含体中杂蛋白含量低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶蛋白分离，有利于分离纯化； ④对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁与细胞膜碎片分离。 尚辅网 20.1.2 包含体的特性 尚辅网 20.2 包含体蛋白复性的理论基础 1 2 蛋白质折叠机理 包含体复性的影响因素 尚辅网 20.2.1 蛋白质折叠机理 ①成核／快速生长模型 ②拼图模型 ③扩散碰撞缔合模型 ④框架模型 ⑤快速疏水折叠模型 ⑥动力学模型 尚辅网 20.2.1 蛋白质折叠机理 尚辅网 20.2.1 蛋白质折叠机理 尚辅网 （１）蛋白浓度 （２）温度和ｐＨ　 （３）稀释倍数 （４）复性辅助因子 20.2.2 包含体复性的影响因素 尚辅网 20.3 包含体蛋白的体外复性 1 2 包含体中活性蛋白的回收步骤 包含体的复性方法 3 复性效果的检测与评价 尚辅网 20.3.1 包含体中活性蛋白的回收步骤 尚辅网 从包含体中回收有生物活性的蛋白需要经历四个步骤： ①从大肠杆菌中提取包含体并洗涤； ②对洗涤后的包含体进行溶解（变性）； ③对变性的蛋白进行体外重折叠恢复活性； ④对复性蛋白进行纯化获得高纯度的蛋白。 20.3.1 包含体中活性蛋白的回收步骤 尚辅网 （１）包含体的洗涤 （２）包含体的溶解 （３）包含体的复性 20.3.1 包含体中活性蛋白的回收步骤 尚辅网 20.3.2 包含体的复性方法 尚辅网 20.3.3 复性效果的检测与评价 ①凝胶电泳 ②光谱学方法 ③色谱学方法 ④黏度与浊度 ⑤免疫学方法 ⑥生物学活性及比活性测定 尚辅网 20.4 蛋白质结构研究技术 1 2 X射线衍射技术 核磁共振技术 3 显微学技术 4 光谱技术 尚辅网 20.4.1 X射线衍射技术 晶体是原子或分子在三维空间中周期性重复排列形成的结构。 Ｘ射线晶体结构分析主要基于衍射线的方向和衍射线的强度两方面原理。 尚辅网 20.4.2 核磁共振技术 分析蛋白质三维结构的最有力方法仍然是Ｘ射线晶体衍射方法，它能精确地确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角等。 核磁共振波谱测定蛋白质结构大部分蛋白相对分子质量是10000-30000。DaTROSY方法出现使得核磁共振波谱测定蛋白质结构原则上不受分子质量的限制，尽管实际工作仍然有很大困难。 尚辅网 20.4.3 显微学技术 * * * *