不可培养微生物研究进展.ppt

不可培养微生物研究进展 第四组 主讲人： 组员： 不可培养微生物的概念 Colwell 实验室在1982年提出活的但不可培养微生物的概念，他们发现将霍乱弧菌和大肠埃希菌（简称大肠杆菌）转到不含营养物质的盐水中，经长时间的低温保存，细菌会进入一种数量不减、有代谢活力、但在正常试验室培养条件下不能生长产生菌落的状态，称为活的但不能培养（viable but nonculturable, VBNC）状态。 其后对多种属细菌进行试验证明，这种不可培养状态是普遍存在的。自然界中也广泛存在着这种活的但不可培养微生物，在各种生境中仅有小部分的微生物可用实验室方法分离培养，而未被培养的种类却代表了巨大的多样性。 严格说来, 这个概念并不严谨。所谓不可培养, 其实应该是在当前认识水平或实验条件下的不可培养。实际上, 通过合适的培养方法, 某些细菌是可以实现培养的。 例如在培养基中加人降解过氧化氢的过氧化氢酶或者非酶类的降解物如丙酮酸钠等, 可以使处于不可培养状态的大肠杆菌恢复培养〕。又比如, 一种滕黄色微球菌的自分泌生长因子讨以皮摩尔浓度加人到培养基中, 可以提高从腹腔巨噬细胞裂解物中分离感染的结核分枝杆菌的比率其中有部分是不可培养的。Joseph等发现, 通过改进一些简单的培养方法, 就可以使实验室培养土壤细菌的种类和数量得到很大的提高。 VBNC细菌的分类 常见的一般情况下实验室条件可以培养的细菌,如霍乱弧菌等, 它们在某些条件下能够进人不可培养状态。 是对人工培养有特殊要求的微生物, 当改变培养基营养、时间和物理环境, 可以培养的微生物。后者通过提取环境样品中总DNA, 构建多元性基因库, 对16S rRNA 序列分析检测基因来源。 不可培养微生物的研究进展 随着分子生物学、基因工程学的发展, 为环境中不可培养的微生物的研究提供了更多新的方法和思路。本文主要从经诱导进入VBNC 状态的细菌的生物学特性、出现条件及检测方法等方面, 对VBNC 细菌研究进展做一综述。 一、细菌VBNC的诱导因素 在自然环境中, 细菌多处于长期的饥饿状态，而进入VBNC 状态可以增强细菌在寡营养环境中的存活能力。 当细菌进人不可培养状态后, 与其正常培养状态菌体比较, 对于高温、高盐以及酸性环境等不利条件有更强的抵抗力, 说明某些细菌的不可培养状态是对不利环境的一种适应, 有利于细菌在不利环境中生存。 细菌VBNC诱导的具体例子： 低营养诱导的VBNC 细胞有霍乱弧菌、痢疾志贺菌、肠球菌、大肠埃希菌、沙门菌等。P. Mary等[ 3] 研究了进入VBNC 细胞的营养条件,把气单胞菌放在4 ! 的寡营养的无菌蒸馏水中7周则观察不到可培养菌落的数量, 这表明已经进入到了VBNC 状态。如果在25 ! 培养10 周以上, 有活力的细胞的数量降低到了0. 8对数单位,这时细菌已经进入到了经典饥饿状态, 可以观察到缩成球形的VBNC 细胞。大多数文献资料显示, 温度是诱导细菌进入VBNC 状态最重要的因子, 而且温度常和寡养条件协同作用。S. M. N el??son等[ 4] 研究表明, 在只提供少量氮源、无碳源的情况下E. coli在5 ! 培养1 000 h 可进入VBNC状态, 通过各种方法测定的特定温度下的菌落数的结果是一致的。温度诱导的VBNC细胞有军团杆菌、创伤弧菌等。N aC l对多数肠道菌的生长影响较大, 徐怀恕等[ 1] 发现E. coli在25% N aC l环境中培养96 h 比在5% N aC l下培养同样时间进入VBNC状态的细菌数目高出40倍之多。此外, 氧化、渗透压等因素也可以诱发VBNC 状态的出现。链缩短, 青霉素结合蛋白在VBNC 阶段消失。Tho lozan[ 8] 发现, Campy lobacter jejuni 进入VBNC状态后膜内外pH 梯度、膜内K+ 浓度和膜势能均降低, ATP及ADP浓度降低, 30 d后仅能检测到AMP存在。 二、细菌VBNC状态的生物学特性 1、VBNC细菌的形态 细菌进入VBNC 状态后形态会发生改变, 大多数的杆菌和弧菌进入VBNC 状态后会缩成球状, 特别是G- 杆菌表现尤为明显。S ignoretto等[ 5] 研究VBNC 状态的G- 菌粪肠球菌( Entero??coccus faecalis)的形态变化时发现其不但没变小,反而有轻微的伸长。 2、VBNC细菌的生理、生化特性 细菌进入VBNC 状态后, 菌体对底物利用减少, 核糖体及染色