多维高效液相色谱%2f毛细管电泳分离在蛋白组学研究中的应用.pdfVIP

PL一008 多维高效液相色谱／毛细管电泳分离在蛋白组学 研究中的应用 张玉奎 (中国科学院大连化学物理研究所，国家色谱研究分析中心) Genomie 随着人类基因测序的基本完成，人类基因组计划(Human Project)开始进入到 后基因组时代。蛋白质组学(proteomics)已经成为功能基因组学研究的重要领域，其重要 组学(functionalproteomics)两部分内容。表达蛋白组学研究基因编码所有蛋白质的识别和 定量，及其在细胞中的定位和在后转录阶段进行的修饰。而功能蛋白组学主要研究蛋白质之 间的相互作用，确定蛋白质在特定通道和细胞结构中的作用，说明蛋白质结构和功能间的相 互关系。 二维聚丙烯凝胶电泳(2D—PAGE)是一种利用蛋白质等电点和分子大小的差异进行正交 分离的分析方法。自从1975年由O’Fmel建立以来，由于其无法比拟的高分辨率在蛋白质 组研究中始终占据着重要的地位。然而2D也存在一些难以克服的缺陷，比如有限的 动态范围和分离样品中大小差别较大的蛋白、低含量的蛋白(如信号蛋白和转录因子)以及 疏水蛋白(膜结合蛋白和跨膜蛋白)的能力，操作过程费时费力，难以实现与质谱(MS) 的直接联用等。这些缺陷限制了其在蛋白质组学中的应用，因此发展新型高分辨率、高通量、 高峰容量分离分析方法已成为加快蛋白质组学研究的瓶颈。 近年来，高效液相色谱(吼C)和毛细管电泳(CE)的发展为蛋白质和多肽的分离分 析提供了新的手段。然而一维分离模式所能提供的分辨率和峰容量往往十分有限。多维 HPLC／CE方法可以采用多种不同的HPLC模式(尺寸排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、 反相色谱等)和CE模式(毛细管区带电泳、等电聚焦、胶束电动色谱、毛细管电色谱等) 通过在线或离线的方式进行偶联，从而实现对复杂样品的分离。尽管这种新型的多维液相分 离模式的分辨率和2D．PAGE相比仍有待进一步提高，但它具有灵敏度高，分析速度快；可 以通过不同的分离模式的偶联来实现对样品中分子大小差别较大的蛋白、低含量的蛋白以及 疏水蛋白的分析；可以直接和MS联用；以及易于实现系统的实现自动化等优点。因此，作 为和2D互补的一种分离模式，它在蛋白组学研究中己开始发挥重要的作用。 前者是对于复杂混合物(如细胞的溶解产物)中所有蛋白质的分析；而后者则是对其中一种 或某一类组分的分离分析。针对研究目的的差异，在多维液相分离中采用的分离模式也将不 同。前者主要采用几种高分辨率的分离模式，而后者通常采用高选择性的亲和分离模式。根 据分离机理的不同，多维分离模式可以分成多维HPLC、多维CE以及多维HPLC—CE三大 类。此外，根据各维分离模式闯连接方式的不同，也可以分为在线分离和离线分离两类。 目前多维HPLC在蛋白组学研究中占有十分重要的地位。由于反相液相色谱(I冲LC) 具有分析速度快、分离效率高、流动相组分与MS匹配等优点，通常被选为多维色谱分离中 最后一维的分离模式。而尺寸排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEC)、亲和色谱(AC)等 可以作为样品的预分离模式。 维蛋白质识别技术，采用双固定相柱(同一根柱内依次填充IEC和RPLC填料)来避免复 eerevisiaestrainBJ5460 杂的阀切换系统，减少系统的死体积。将该技术应用于Saccharomyces to phase的蛋白组研究中，共检测和识别出1,484种蛋白质，其中包括低丰度 grownmid-log 蛋白(如转录因子和蛋白激酶)和131个跨膜区域的蛋白质。所有识别的蛋白质跨越的动态 范围可以至少达到10，000：1。 2D．AC．RPLC在蛋白质的目标谱研究中发挥了重要的作用。和多维HPLC相比，多维 CE在蛋白组研究中的应用正处于起步阶段。利用毛细管胶束电动力学色谱(MEKC)和毛 细管等电聚焦(CIEF)在线二维分离模式可以在4分钟内完成了对一种蛋白质水解产物的 浓缩、分离和检测。通过微透析界面2D．CIEF-毛细管区带电泳(CzE)分析蛋白水解肽， 峰容量可以达到1,600左右。我们采用中空纤维实现流动相的在线置换构建的CE／CE分离 平台，已用于血红