半巢式RT-Realtime+PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系.pdfVIP

2010年进出境植物检疫学术研讨会论文案 半巢式RT—ReahimePCR检测马铃薯Y 病毒脉坏死株系 耿金培 粟智平 张京萱 方绍庆 王真 (烟台出入境检验检疫局山东烟台264000) PCR检测PVY。的新方法。该方法有机地结合了 物和I条TaqMAN荧光探针，建立了半巢式RT—Reahime PCR既是对第一步信号的进一步放 巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式一RT—Realtime 大，也是对第一步PCR产物的确认，检测的准确性和灵敏度比巢式PCR、一般Real—timePCR等方法高，检 测限可达4fg／l山L植物总RNA。 关键词 马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVY“)；半巢式RT—Reahime；PCR；检测 vires 马铃薯Y病毒(PotatoY，PVY)是马铃薯1．2主要的仪器及试剂 PARISM 中一种最重要的病害之一，严重的减产可达80％以 实时荧光PCR仪ABI 7000、核酸蛋白 上，甚至绝产。PVY是马铃薯Y病毒科、马铃薯Y分析仪等；植物总RNA提取试剂盒：商品名E．Z。 病毒属的代表种，分布于所有马铃薯种植区。马铃 N．A。M购自北京双赢；反转录试剂盒、实时荧光PCR 薯Y病毒目前已有多个株系被鉴定，目前认为PvY试剂购自大连宝生物公司(Ta‰Ra)。 1．3 有三个株系，其中普通株系(PVYo)世界范围内广 TaqMAN探针与引物的设计合成 泛分布，坏死株系(PVY“)主要发生在欧洲、非洲、 根据PvY“基因组中RNA依赖的RNA聚合酶 美国南部和加拿大东部地区，C株系(PvY6)在北 美洲不发生。马铃薯Y病毒脉坏死株系是马铃薯 和三条引物，探针5’端标记FAM，3’端标记TAM一 等作物中一个非常重要的植物病毒病害，在我国东 RA，引物与探针由TaKaRa合成。 北和黄淮烟区为害严重。 本文中半巢式RT—ReahimePCR引物包括1 检测马铃薯Y病毒(PvY)的方法主要有对外围扩增引物(上下游引物分别用P1、P2表示) ELISA、电镜技术和RT—PCR技术。这些技术操作和l条半巢式引物(正向引物，用Cl表示)：P1：5 步骤繁琐、检测周期长、灵敏度低，且易于造成环境 交叉污染，出现假阳性结果。目前还未见采用实时 荧光PCR检测该病毒的研究报道。 本研究建立了一套“半巢式RT—Reahime 3。P1／P2 PCR产物 PCR”检测PVY“的新方法。与目前已报道的其它 PCR产物长度为266bp，C1／P2 检测方法相比，该方法具有更准确、灵敏、快速、简 长度为225bp。 便等特点。 1．4总RNA提取及质量控制 l材料与方法 用植物总RNA提取试剂盒从感染上述4种病 1．1实验材料 毒的白肋烟叶片及健康大豆叶(CKl)片中提取总 RNA，测定OD值，并以此确定其质量。 马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVY“)、南芥菜花 1．5反转录合成cDNA 叶病毒(ArMV)、马铃薯x病毒(PVX)、马铃薯黑 环斑病毒(PBRSV)毒源及病毒接种寄主白肋烟由 将1．4中所提取的5个植物总RNA及水对照 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所提供。