各种DNA提取方法.pdfVIP

中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/ 电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http: 各种DNA 提取方法 一，基因组DNA 提取方法 制备基因组DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的 片段的长度不小于100-200kb。在DNA 提取过程中应尽量避免使DNA 断裂和 降解的各种因素，以保证DNA 的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB 方法，其他的方法还有1 物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2 化学方 式：异硫氰酸胍法碱裂解法3 物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有: 硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS 漂洗 次，离心收集。试验步骤2 再重新作 边。 3、加入5mlDNA 提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS) 混匀。 4 、加入25ul 蛋白酶K 使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提 次，2500rpm 离心收集水相，用等体积的 （酚，氯 仿，异戊醇）混合物抽提 次，2500r/min 离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提 次。加入等体积的5mol/L 的LiCL 混匀， 冰浴，10min.。 7、2500rpm 离心10min.转上清于 离心管中。加入等体积的异丙醇。室温 10min。 2500rpm 离心10min。弃上清。 8、加入0.1 倍体积3mol/L 乙酸钠(PH5.2)与2 倍体积-20℃预冷无水乙醇。 -20℃20min。 9、12000r/min 室温离心5min。弃上清。将DNA 溶于适量TE 中。 二，外周血DNA 提取技术 分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml，EDTA 抗凝，2500rpm 离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3 个0.5ml 离心管中。 3、在血细胞中加入3 倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4 、2500rpm 离心10min，弃上清。 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/ 电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http: 中国生物电泳网 专业销售维修：各种电泳槽/ 电泳仪/紫外仪等电 泳设备 http: 5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm 离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80℃冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4 ℃放置不超过5h， 以防白细胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer ： 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA 0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。 ACD 抗凝剂：柠檬酸1.68g 柠檬酸钠4.62g 葡萄糖5.15g；最后加灭菌去 离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer ）： 10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mM EDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500 l 抗凝血中加入ligsisbuffer1000 l，充分颠混至清亮。以4000rpm， 离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500 l，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500 l （裂解细胞），混匀置于37 ℃，水溶1h。 4 、加入8 l 的蛋白酶K，颠混，37℃过夜 （或55℃，3h，但是37℃效果 要好些）。