重组瑞替普酶包涵体制备及其体外复性.pdfVIP

第 66 卷 第2 期 化 工 学 报 Vol.66 No.2 February 2015 2015 年 2 月 CIESC Journal ·709 · 重组瑞替普酶包涵体制备及其体外复性 王俊雄，关怡新，姚善泾 （浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江杭州 310027 ） 摘要：将携带重组瑞替普酶(reteplase, rt-PA) 的质粒成功转化到大肠杆菌BL21(DE3)后，诱导表达获得包涵体，考 察了诱导剂浓度、培养温度和培养时间等条件对目标蛋白表达量的影响。在此基础上，对高效表达的 rt-PA 包涵 体体外复性过程进行了详细研究。首先利用单因素实验考察了复性液 pH 、GSH 浓度、GSH/GSSG 比例、蛋白浓 度等各种复性条件对复性效果的影响；并结合正交实验设计，进一步研究了高蛋白浓度下复性后 rt-PA 酶活变化 情况。以 0.2 mmol ·L− 1 IPTG 诱导，在 33℃下培养 6 h，每升发酵液约可获得 1.7 g 粗制包涵体。适宜的复性条件 为蛋白浓度 50 μg ·ml− 1，pH 10.0 ，GSH 浓度 1 mmol ·L− 1，GSH/GSSG 比例8，复性收率为 87.2%。影响高蛋白 浓度下 rt-PA 复性的关键因素为复性液初始 pH 及 GSH 浓度，在 800 μg ·ml− 1 蛋白浓度下复性后 rt-PA 比活可达 4 − 1 7.54×10 IU ·mg ，荧光光谱分析结果表明复性后rt-PA 恢复了其天然态结构。 关键词：生物分离；蛋白质复性；二硫键；正交实验设计；瑞替普酶 DOI ：10. 11949/j.issn.0438-1157 中图分类号：TQ 028.8 文献标志码：A 文章编号：0438—1157 （2015 ）02—0709—08 Preparation of recombinant reteplase inclusion bodies in E. coli and its refolding in vitro WANG Junxiong, GUAN Yixin, YAO Shanjing (College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China) Abstract: The vector with the gene of recombinant reteplase (rt-PA) was cloned into E. coli BL21(DE3) cells. Over-expression of rt-PA as inclusion bodies was obtained, and renaturation of rt-PA in vitro was investigated. Firstly, single factor experiments were cond