焦测序技术及其在遗传分析中的应用.pdfVIP

第34 卷 分析化学 （FENXI HUAXUE ） 评述与进展 第4 期 2006 年4 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 582 ~ 586 焦测序技术及其在遗传分析中的应用 l 2 l，2 张晓丹 武海萍 周国华＊ l （中国药科大学生命科学与技术学院，南京2l0009 ） 2 （华东医学生物技术研究所，南京2l0002 ） 摘 要 焦测序技术是一种新的实时DNA 测序技术。它在DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和 三磷酸腺苷双磷酸酶4 种酶的协同作用下，使引物延伸聚合脱氧核糖核酸（GNTP ）释放焦磷酸盐（PPi ）、PPi 转换三磷酸腺苷（ATP ）、ATP 产生荧光信号与GNTP 和ATP 的降解等化学反应偶联起来，检测结果准确可靠。 本文综述了焦测序技术的基本原理、操作步骤和它在单核苷酸多态性（SNP ）研究、微生物的分型鉴定和基因 甲基化检测等遗传分析中的应用，并对焦测序技术的发展作了展望。 关键词 焦测序技术，单核苷酸多态性，等位基因频率，微生物的分型鉴定，基因甲基化，评述 ! 引 言 DNA 序列测定技术是现代生命科学研究的核心技术之一。随着分析科学的进步，阵列式毛细管电 ［l］ 泳测序技术的发明，使人类基因组计划比原计划提前两年完成 。目前普遍使用的DNA 序列分析技术 基本都是基于双脱氧核苷酸链终止法（Sanger 法），其原理是以DNA 单链为模板，在一定条件下，用模板 特异性引物在DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，不断将4 种脱氧核糖核苷酸（GNTP ）和经 不同颜色染料标记的双脱氧核糖核苷酸加到引物的3 -羟基末端并使引物链得到延伸或使延伸终止，得 到各种连续长度的DNA 片段，通过电泳分离，用激光诱导荧光法可以检测到各片段末端碱基的种类。 通常该法可以测定500 个左右碱基的序列。该方法的主要不足在于：只能定性不能定量；适合大规模测 序不适合测定单碱基差异；不能测定引物后面的碱基序列。新发展的焦测序 （pyroseguencing ）技术［2 ］ 可以克服这些缺点，在进行DNA 序列分析时不需要电泳和荧光标记，可以直接测定引物后面的碱基序 列，定量性能好，结果准确，可实现自动化。人类进入后基因组时代的主要任务之一就是大规模测定人 类基因组的差异（如SNP ）与疾病易感性和药物敏感性的关系，寻找基因甲基化与疾病发生发展的关 系。因此焦测序技术在后基因组计划中将发挥巨大作用。本文介绍了焦测序技术利用化学反应进行测 序的原理，对其在SNP 检测、病原微生物的快速鉴定、基因甲基化分析等方面的应用作了评述。 # 焦测序技术的原理和基本操作 # . ! 焦测序的原理 ［3 ］ 焦测序技术是一种基于发光法测定焦磷酸盐（PPi ）的测序技术 。其原理是：引物与模板DNA 退 火后，在DNA 聚合酶（polymerase ）、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase ）、萤光素酶（luciferase ）和三 磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase ）4 种酶的协同作用下完成循环测序反应。当加入的GNTP 与模板互补时， DNA 模板与互补的GNTP 聚合时可以产生等摩尔PPi ，在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi 与5 -磷酸 化硫酸腺苷（APS ）反应生成等量的ATP ；在萤光素酶催化作用下，ATP 与虫萤光素（luciferin ）反应发光， 最大波长约为560 nm ，可用光电倍增管（PMT ）或电荷耦合装置（CCD ）检测。产生的荧光信号强度与聚 合的GNTP 个数成正比，根据加入的GNTP 类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA 的核苷酸序列。 在焦测序技术