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补充： 酶类药物 酶类药物的提取和纯化 2.结晶的条件选择 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD） 1.以牛肝为原料提取Mn-SOD的工艺 2.以牛血红细胞提取Cu、Zn-SOD的工艺 * * 酶的分类 原料选择 生物材料的预处理☆ 提取 浓缩☆ 纯化 结晶☆ 动物材料的预处理： （1）机械法：有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法， 有些酶用机械法处理后仍不能有效的提取，可结合其 他处理法。 （2）冻融： 冷到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。 由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高， 能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，使酶释放出来。 （3）丙酮粉：组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少 酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂 质结合的某些化学键打开，促使某些结酶释放到溶液中。 材料的预处理 酶的浓缩 （1）工业上：超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、 冷冻浓缩 （2）实验室： 除上述方法外，对少量样品可用下列方法 1. 用G-15或G-25浓缩 2. 用聚乙二醇浓缩 注意两个问题：1.建立快速的测定酶活力的方法 2.建立活力回收表 酶的纯化：凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化 从大肠杆菌中提取天冬酰胺酶活力回收表 酶的结晶 ☆ 特征：有序性，对称排列，周期性的重复结构 —— 为空间结构研究提供x-衍射样品 1.酶的结晶方法 缓慢改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。 （1）盐析法 （2）有机溶剂沉淀法 （3）复合结晶法 （4）透析平衡法 （5）等电点法 既是纯化的结果又是纯化的手段 酶的纯度 酶的浓度 金属离子 pH 温度、时间 晶种 酶的分离纯化工作中的注意事项 1. 防止酶蛋白变性 2. 防止辅因子丢失 3. 防止酶被蛋白 水解酶降解 结构特点：金属酶 Fe-SOD: Mw38000，2个亚基，每个亚基含1个Fe，存在 于 中 Cu、Zn-SOD: Mw32000，2个亚基，每个亚基含1个Cu，1个 Zn，存在于 中 Mn-SOD: 原核细胞中，Mw40000,2个亚基，每个亚基1个Mn 真核细胞中，Mw80000，4个亚基，每个亚基1个Mn 真核细胞 原核细胞 酶的性质 稳定性 对热稳定：天然牛血SOD可75℃加热数分钟，对热 稳定性与溶液离子强度有关 对pH的稳定性：一般pH5.3~9.5较稳定，猪血SOD在 pH7.6～9较稳定 金属辅基与酶活性关系 Cu、Zn-SOD：Zn与分子结构有关，与催化活性无关 Cu与活性有关，对酶活力是必需的 Mn-SOD：Mn对酶活力是必需的 Fe-SOD：Fe对酶活力是必需的