--第一次分子生物学研究方法.ppt

5.1 重组DNA技术发展史上的重大事件 重组DNA技术 用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。 通过体外操作将不同来源的DNA重新组合以获得新功能分子的技术。 5.2 基因操作的主要技术 　　　　　5.2.1 DNA分子的切割 （运用限制性内切酶对DNA分子进行切割） 5.2.3 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA片段的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的分子生物学研究方法。 ? 一、基本原理 ? 一种带电分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度、电泳分子本身所携带的净电荷数、分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关系 。 在一般情况下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。 大分子量的DNA 移动的慢 小分子量的DNA 移动的快 电泳缓冲液 阳极 阴极 DNA加样孔 二、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2－50kb之间 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间 凝胶类型及浓度 分离DNA片段的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 000－1 000 0.7%琼脂糖 20 000－1 000 1.4%琼脂糖 6 000－300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000－100 10.0%聚丙烯酰胺 500－25 20.0%聚丙烯酰胺 50－1 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 ２、核酸电泳的指示剂 指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色 电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 琼脂糖凝胶浓度 0.6% 1% 1.4% 2% 迁移率 1Kb 0.6Kb 0.2Kb 0.15Kb 二甲苯青：水溶液呈兰色， 电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当 琼脂糖凝胶浓度 1% 1.4% 迁移率 2Kb 1.6Kb 上样缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 作用： ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 ②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可观察核酸电泳的情况 ③使样品呈色，使加样操作更方便 ３、核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂：溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 致癌性 在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EB）染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。 在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光 结果 称样 溶解 加热 制板 倒胶 电泳操作基本程序 取样 点样 电泳 检测 我们常遇到 某些人容易感染某种疾病，而另 一种人则不会； 同一种治疗肿瘤的药物对一些人 非常有效，另一些人则完全无 效； 相同的病例、相同的处方，可疗 效却大相径庭； 继国际人类基因组计划之后，一个全球性的科学家联合组开始为这一系列有疑问的现象寻找答案,其原因在于他们基因组中存在的 差异。这种差异很多表现 为单个碱基上的变异。 也就是 单核苷酸多态性（SNP） 何谓SNP(单核甘酸多态性)？ 虽然同种生物其染色体差异极小,但平均1000个碱基对(base pair)就有一个发生突变,这些变异称为SNP,是造成个体的血型、身高、对药物的敏感性等差异的原因。此外,SNP也和癌症、心血管疾病、自体免疫等等疾病有关。 5.2.5 单核苷酸多态性(SNP) １.定义 单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个 核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 SNP