.DNA的复制、修复与重组DNA技术.ppt

第十二章 DNA的复制、修复与重组 分子生物学中心法则(central dogma) 1958年 Crick 1970年 Temin 和 Baltimore DNA RNA 蛋白质 第一节 DNA复制的原则 ?半保留复制(semiconservative replication) ?半不连续复制(semi-discontimuous replication) ?RNA引物 ?复制起始点和复制方向 复制的真实性 1、半保留复制 2、碱基互补配对原则 3、RNA引物 4、DNA聚合酶：校读功能 5、端粒与端粒酶 6、DNA的损伤修复机制 7、尿嘧啶-DNA糖苷酶 DNA（T） RNA（U） 1、DNA重组：指两个DNA分子之间，或一个DNA分子的两个不同部位之间，通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的组合与序列。这种现象可发生在同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的DNA分子间。 ? 2、DNA重组技术： 在实验室内，用人工方法将不同来源的DNA分子拼接成一个重组(recombinant) DNA分子，并将其引入活细胞内，使其大量复制或表达，这种技术称为DNA重组技术或基因工程。 （1）重组分子的构建（接） （2）引入宿主细胞（转） 转化 转染 感染 （3）筛选（筛） 2、端粒酶：防止端粒缩短的一种逆转录酶 组成：由RNA和蛋白质组成 蛋白质 — DNA聚合酶 RNA — 模板 唯一携带RNA模板的逆转录酶 功能：复制端粒序列，防止端粒缩短。 机制： 端粒、端粒酶与肿瘤： 生殖细胞、干细胞：端粒酶活性保持 体细胞：端粒酶活性下降，正常衰老现象 恶性肿瘤细胞：端粒酶的活性恢复，使细胞永生化，形 成恶性增殖 1994年，Couter 人卵巢细胞 端粒酶表达 1997年，人端粒酶基因克隆 85%肿瘤细胞中端粒酶活性升高 第四节 DNA的损伤与修复 一、 DNA损伤的因素 1、自发因素 环境中溶剂分子随即热碰撞 N-糖苷键断裂，A、G脱落 磷 酸 戊 糖 碱 基 2、物理因素 紫外线 电离辐射 共价交联，嘧啶二聚体 单（双）链断裂，碱基脱落破坏，分子交联，脱氧核糖破坏 3、化学因素 亚硝酸盐 C U 二、 DNA损伤的类型 1、点突变 转换 同型碱基 颠换 异型碱基 调控序列 影响基因表达 编码序列 有意突变— 改变蛋白质功能 无意突变— 个别氨基酸改变，蛋白质功能不变 静止突变— 个别碱基改变，氨基酸不变 镰刀型红细胞贫血 N - Val . His . Leu . Thr . Pro . Glu . Glu …….- C N - Val . His . Leu . Thr . Pro . Val . Glu …….- C 5` - *** . *** . *** . *** . *** . CTC . ***………- 3` 5` - *** . *** . *** . *** . *** . CAC . ***………- 3` 2、缺失 一个核苷酸、一段核苷酸、一个基因 Lesch-Nyhan`s综合症 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）基因丢失 3、插入 一个碱基、一段核苷酸 芳香族分子等 移码突变 4、倒位 二、DNA损伤的修复机制 1、光修复机制 低等生物 解聚嘧啶二聚体 不需要光复活酶 需要光复活酶 2、切除修复机制（暗修复） 所有生物 切割3`5`磷酸二酯键（扩创）、填补、连接 UV特异的核酸内切酶 着色性干皮病 ② AP特异的核酸内切酶 ③ DNA聚合酶I（5`→3`外切） P P P P O O O O 5` 3` ④ DNA聚合酶I（5`→3`聚合） 3、碱基切除修复机制 ① DNA糖苷酶 ⑤ DNA 连接酶 ① 切割错误碱基→② 切割3`5`磷酸二酯键→③ 切除、填补→④ 连接 DNA糖苷酶：特异识别一种DNA分子中改变的碱基， 并水解该碱基与脱氧核糖间的糖苷键,形成AP位点。 AP特异的核酸内切酶：切割3`5`磷酸二酯键 DNA聚合酶I：切除损伤链，填补缺口