._DNA重组技术的基本工具课件.ppt

多克隆位点英文名称：multiple cloning site;polycloning site;MCS 定义：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 一个切割位点 目的基因 一个切割位点 载体的条件⑴ 有1~多个限制酶切点 载体的条件⑵对受体细胞无害 ⑶能在受体细胞中复制和表达 载体的条件⑷具有标记基因 1 载体需要的条件： ⑴ 有1~多个限制酶切点 ⑵对受体细胞无害 ⑶导入基因能在受体细胞中复制或整合受体 细胞的DNA上、表达 ⑷有某些标记基因，便于筛选 三、“分子运输车” ——载体 2 常用运载体： ⑴细菌的质粒 ⑵λ噬菌体衍生物或某些动植物病毒。 有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。 有切割位点 能复制并带着插入的目的基因一起复制 裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。 最常用运载体——质粒 实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 议一议 2、能否用SARS病毒作为基因载体？ 3、作为载体，若没有切割位点将怎样？ 4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？ 5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？ 1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？ 双链DNA 不能 不能进行DNA的重组 载体上应有标记基因 可能造成基因丢失 练习 在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶 不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D 练习 3) 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达 C 练习 * * * * * 专题一： 生物1的基因（目的基因） 生物2 获得新性状 导入 第一至三步骤 三个工具 第四步骤 限制酶 DNA连接酶 运载体 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 1 名称来源：限制性核酸内切酶，又称限制酶 主要从原核生物中分离纯化。 2 作用特点：识别特定核苷酸序列，使每条链中 特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 1. 种类与命名 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。 粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens） SmaⅠ 大肠杆菌 （Escherichia coli R） EcoRⅠ 练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ 命名方法 作用特点——断开磷酸二酯键 磷酸二酯键 T 1 2 3 4 5 A 1 2 3 4 5 H H H H HO T 1 2 3 4 5 A 1 2 3 4 5 H H H H O H2O + * 仔细观察各限制酶 识别的特定序列有何 特点？ 限制酶的识别序列 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列 作用特点——断开磷酸二酯键 　 EcoRⅠ 黏性末端　　　　 黏性末端 作用特点——断开磷酸二酯键 SmaⅠ 平末端 　　　平末端 A A T T G C C T T A A G 限制酶 DNA解旋酶 区别 限制性内切酶与DNA解旋酶的区别 切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键 将DNA两条链的氢键打开形成两条单链 限制酶 DNA水解酶 区别 限制性内切酶与DNA水解酶的区别 切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA. 切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物 在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机 制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细 菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会 利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自