狂犬病实验室检测与诊断技术.ppt

狂犬病的实验室检测与诊断技术 中国生物技术集团公司 武汉生物制品研究所 基因工程室 严家新 徐葛林 1. 临床诊断与实验室诊断 2. 人狂犬病的生存期内诊断 生存期内的诊断技术的选择主要随着病程的不同而异。 在病后最初几天，检测抗原一般是敏感的。 脑脊液及血清中的病毒中和抗体常常趋向于在病后7—10天出现。 检测抗原可用荧光抗体（FA）法检查狂犬病患者角膜印片或皮肤活组织，但是，FA阳性标本在发病的后期更常见。皮肤活组织检查常常从颈背部取含有末稍神经的带有毛囊的标本。 角膜印片(切勿划痕)取自伴有脑炎的患者，用显微镜的载波片轻轻触及角膜的中心部位。 角膜印片及皮肤活组织标本的质量很重要，采取后应立即冷冻，直至检测。不过，用FA技术做生存期内的诊断，其敏感性是有限的。 人狂犬病的生存期内诊断 已证实患者及自然感染和实验感染动物的角膜印片中存在狂犬病抗原。但是，角膜印片检出率较低，阳性结果可肯定是狂犬病，而阴性结果并不能排除是狂犬病的可能。 虽然在临床症状开始时，在皮肤活组织中可能检出狂犬病抗原，但早期症状时仅有25-50%的患者为阳性，随着病情的进展阳性率也增加。颈背部皮肤活组织检查只有一些患者呈阳性结果，特别是在临床疾病的早期。 　　用FA检查皮肤活组织的灵敏度一般高于检查角膜印片。 3. 动物和人狂犬病的死后诊断 抗原检测 病毒分离 病毒鉴定等。 为了确保实验室结果的可信性，必需满足若干条件： 1. 标本质量要好； 2. 标本送达实验室的条件要好（符合GLP标准，　　 获得一定级别的资格认证）； 3. 获得结果的等待时间要短； 4. 结果的传递要迅速。 二　狂犬病诊断实验室的安全措施 1. 危险性 　在一般的实验室条件，技术人员暴露于以下传染的危险： ——野生狂犬病毒(即街毒)，当实验室对接收到的动物标本进行尸体解剖时或对标本进行加工时(悬液制备，离心)等，这一类操作是非常危险的，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。 ——实验室适应的病毒(即固定毒)，当接种实验动物或操作感染的细胞培养时，特别是制备大量的高浓度病毒时，主要的传染来源为手指被有感染的玻璃或工具刺伤或割破；新糜烂的皮肤或粘膜与感染物接触也应认为是一种传染的危险。虽然固定毒的毒力已大为下降，历史上仅有一例死于固定毒操作的报道，但仍有一定的危险性，因此操作固定毒仍须十分小心。 2. 对安全操作的建议 操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在 P2或P3生物安全实验室内进行。 对狂犬病实验室诊断的安全性要求： ①一个封闭的环境，专作狂犬病感染性工作 ②通过缓冲更衣间并限制一定的专业人员进入； ③穿专用的实验室隔离无菌衣和鞋； ④操作完毕对操作台进行消毒(当材料偶然地溢出时应立即用3％的雷苏尔溶液或其他相应的消毒剂消毒)； ⑤每日应至少消毒地板一次； ⑥所有用后剩余的标本，尸解工具，实验室材料在拿出实验室前应进行高压蒸气消毒。 在生物安全柜或隔离器内打开动物颅盖骨的操作很困难，技术人员在操作这项工作时应带面罩，护目镜、手套和围裙。 由于与狂犬病相关病毒对人的致病性还不很了解，所有操作可能含有这些病毒的标本均应在生物安全柜内进行。 所有实验室工作人员务必进行狂犬病疫苗的暴露前免疫，这些人员的中和抗体应定期检查，所有意外地暴露于感染时必需立即报告负责人。 三 狂犬病毒抗原的检测 1. 标本选择 在选择、运送标本前，实际操作获得标本的人员与实验室检测人员事先取得联系共同选择实验方法是很重要的。 1) 标本取自个体的生命期 Ａ．检查病毒和(或)抗原：样品应放在干燥试管内。样品的获取可按下述方法进行。 (1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮肤活检等样品。 (2)角膜涂片，用显微镜载玻片直接接触角膜操作(不要用棉拭)，标记玻片，空气干燥并用铝锡纸单片包裹。 Ｂ。检测抗体：血液、CSF或血清采集于干燥试管内，并低温冰冻存放。 2) 标本取自死亡后的个体 送至实验室标本的方式依动物种类不同而不同。 (1) 小的野生动物(包括蝙蝠) 送完整的个体以便对动物品种进行准确鉴定。 (2) 家养食肉动物(狗、猫)或野生食肉动物 (狐狸、貉、浣熊、臭鼬、豺等) 仅送头部。 (3) 更大的动物(家养