实验八 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾.ppt

了解凝胶层析的原理及应用 通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术 凝胶过滤层析： 高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色，Mw=64500)， 完全排阻 钼酸铵 + 氨基萘酚磺酸 + 磷酸盐 层析柱稳定后接储液瓶，打开出口，用两倍于床体积的缓冲液洗脱平衡(5-10min )，不可露出床面，关闭出口 用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中的凝胶吹至小烧杯中回收 MetHb的相对分子量较大，直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较短，移动速度快，首先流出 向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？ 请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或太慢？ 圆盘电泳的分子筛效应和凝胶过滤的分子筛效应原理上有何不同？ 实验项目 实验原理 试剂和器材 操作方法（主要步骤） 结果分析 思考题 实验九 酶法测血清葡萄糖 生物化学与分子生物学实验 实验八凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾 实验目的 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也称分子筛层析、排阻层析 实验原理 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。 交联葡聚糖的凝胶颗粒 分子筛效应： 大分子在前，小分子在后 Hb ﹢ K3Fe(CN)6 MetHb 高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)6，黄色，Mw=327.25) ，可完全进入凝胶颗粒网孔内，从而达到分离的目的 交联葡聚糖 高铁血红蛋白与高铁氰化钾混合物 高铁血红蛋白 高铁氰化钾 利用特制的半透膜把大小分子分开的方法，截止分子量一般为一万 临床应用：血液透析 透析液 浓缩的蛋白混合样品 透析袋 开始透析 处于平衡状态 透 析 法： 钼蓝（蓝色） 15%三氯醋酸+蛋白质 变性、沉淀 实验器材与试剂 层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器 血红蛋白溶液 交联葡聚糖G-25 0.4% K3Fe(CN)6 氨基萘酚磺酸试剂 钼酸铵试剂 15%三氯醋酸 0.1M磷酸缓冲液 实验步骤 凝胶的处理 G-25颗粒(5g) 蒸馏水室温溶胀 去除杂质 10倍体积的蒸馏水浸泡(过夜) 装柱 固定在铁架上 加入缓冲液没过砂芯 将凝胶缓缓注入管内 自然沉降至柱床高度达20cm以上 不可露出创面 盖滤纸 层析管洗净、排出管中气泡 关闭出口 关闭出口 打开出口 装柱要求: 连续 均匀 无气泡 无分层 床面平整 平衡 加样 准备血红蛋白(3滴)与K3Fe(CN)6 (8滴)混合液 自距床面1mm高处靠壁缓慢、均匀加入 至液面降至与凝胶面相平 放掉多余缓冲液至刚露出床面 打开出口 洗脱与收集 至洗脱液刚好流入床面 再加洗脱液至3-4cm高 连接储液瓶 调节活塞（1滴/5秒）进行洗脱 缓慢加入样品量体积的洗脱液 （不冲破胶面） 打开出口 关闭出口 收集红褐色的MetHb色带 带网孔的葡聚糖珠 小分子进入葡聚糖珠内 大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出 凝胶过滤层析过程示意图 洗脱与收集 将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱后，用2~3倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶 将MetHb洗脱液装入透析袋 将透析袋口用止水夹密封 打开磁力搅拌器，透析30分钟 将透析袋悬入装有蒸馏水的烧杯中 透析 磷酸盐的鉴定 ？ 3滴 2滴 10滴 透析后杯内蒸馏水 ？ 3滴 2滴 15滴 透析前杯内蒸馏水 反应结果 氨基萘酚磺 酸试剂 钼酸铵试剂 试剂量 鉴定 蛋白质的鉴定 ？ 20滴 40滴 透析后杯内蒸馏水 ？ 5滴 10滴 透析袋内溶液 ？ 20滴 40滴 透析前杯内蒸馏水 反应结果 15%三氯醋酸 试液量 装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者重新装柱，保持柱床面平整； 洗脱时流速不可太快或太慢； 透析袋中的液体不可装满，否则会将透析袋胀破。 注意事项 磷酸盐的鉴定 3滴 2滴 10滴 透析后杯内蒸馏水 3滴 2滴 15滴 透析前杯内蒸馏水 反应结果 氨基萘酚磺酸试剂 钼酸铵试剂 试剂量 无 蓝色 实验结果 蛋白质的鉴定 20滴 40滴 透析后杯内蒸馏水 5滴 10滴 透析袋内溶液 20滴 40滴 透析前杯内蒸馏水 反应结果 15%三氯醋酸 试液量 无 无 有沉淀 K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中流程较长，移动速度慢，最后流出 磷酸盐是小分子，小于透析袋孔径的小，能够穿过透析袋；而蛋白质是大分