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微生物遗传与育种实验 何琳燕 生科楼C7012 TellEmail：hlyan0974@ 实验目的 掌握微生物遗传与育种的相关研究技术：诱变、杂交、转化、性状检测、遗传分析等 将遗传学知识与育种技术相结合，达到具备独立进行遗传学实验设计、微生物育种技术路线设计与现代微生物分子遗传技术操作能力的目标。 实验内容 多糖产生菌突变株的筛选和鉴定 根瘤菌多糖产量鉴定 根瘤菌抗生素抗性检测和突变株筛选 两亲本杂交 电转化 杂交子鉴定 技术路线 时间安排 分组安排 培养基配制 TY培养基（培养根瘤菌）：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉3.0 g，CaCl2 0.3 g，水1000 ml，pH 7.0。杂交用，250ml液体/500ml三角瓶，每组2瓶。诱变用，250ml固体/500ml三角瓶，每组2瓶。抗性测试用， 50ml固体/250ml三角瓶，每组2瓶。 蔗糖酵母膏培养基（培养根瘤菌）：蔗糖10.0 g，酵母膏4.0 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，钼酸钠（0.5%溶液）4.0 ml，硼酸（0.5%溶液）4.0 ml，碳酸钙5.0 g，水1000.0 ml，pH 7.2-7.4。多糖测定用， 250ml/500ml三角瓶，每组4瓶。 LB培养基（培养大肠杆菌）：胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g， 酵母膏 10 g，水1000.0 ml， pH 7.2。质粒提取用，试管装5 ml，每人2支。杂交用，50ml液体/250ml三角瓶，每组1瓶。 生理盐水： 一、根瘤菌多糖产量鉴定 实验步骤： 摇瓶发酵（实验准备）：200 ml蔗糖酵母膏培养基/500 ml三角瓶（10瓶），接种振荡培养36 h。 观察多糖产量：粘稠 离心：8000 rpm离心10 min，收集上清液 酒精沉淀多糖：在上清液中缓慢加入等体积95%乙醇，沉淀多糖 干燥称重：8000 rpm离心10 min，收集沉淀，60℃鼓风烘干，称重。 二、根瘤菌抗生素抗性检测 实验步骤： 配制含抗生素TY培养基（氯霉素5μg/ml ，利福霉素5μg/ml ）； 接种：斜面→平板； 培养36 h后观察生长情况，确定根瘤菌抗药性。 结果：菌落生长，说明？ 三、用梯度平板法筛选根瘤菌抗药性突变株 1、制备菌液 2、紫外线诱变 3、增殖培养（黑暗下操作） 4、制备梯度培养皿 5、涂布菌液 6、抗药性的测定 三、两亲本杂交 实验步骤： 菌体培养（实验准备）： 根瘤菌：TY培养基5 ml试管，接种，培养20 h 大肠杆菌（pSC123）：LB培养基5 ml试管，接种，培养18h 离心：8000 rpm离心2 min，收集菌体沉淀，用无菌水重悬，再次8000 rpm离心2 min，收集菌体沉淀，用TY培养基1000 μl重悬。 杂交：分别取200 μl根瘤菌和E.coli菌悬液混合，加1000 μl TY培养基，静置24 h后涂布选择性平板筛选杂交子。 选择性平板：无氮培养基（Kn 50 μg/ml，Rif 50 μg/ml） 挑取杂交子在双抗无氮培养基上划线纯化。 四、电转化 实验步骤 准备工作：①制备选择性平板TY培养基（Kn 100 μg/ml，Rif 100 μg/ml）。②提取要转化的质粒DNA，miniTn5。③制备根瘤菌菌悬液。 转化：在电转化用的石英样品杯、质粒DNA、TY培养基、根瘤菌菌悬液50 μl按顺序对应置于冰上预冷。将冰桶移置超净工作台上，取200-1000 μl、20-100 μl、0.5-10 μl 移液器到超净工作台上。先用0.5-10 μl移液器取2 μl质粒DNA到根瘤菌细胞内，再用调节到50 μl 的（20-100 μl移液器）上下吹吸数次。在冰上放置2 min。用调节到50 μl 的（20-100 μl移液器）将质粒DNA和细胞混合液转移到电转化石英样品槽底凹槽的中央，在桌面上轻击数次使之分散。在冰上放置1-2 min。先用纸将样品槽擦拭一下，移到2 kV电脉冲发生器上，同时用1000 μl移液器吸好TY培养基1 ml，约4.5-5 sec后鸣叫声停后，立即加入样品槽内（吹吸一次或不吹吸）。 培养：将细胞悬浮液从样品槽中取出并加入1.5 ml 离心管中，在28℃，200/min振荡培养1 h。在样品槽中加满自来水，以便清洗。将培养后的转化菌悬液在超净工作台上全部倒入1.5 ml微量离心管，12000 rpm离心30 s（或到达13000 rpm后离心15 s）。用1000 μl移液器取出大部分的上清，再用50 μl移液器全部弃掉剩余的上清，之后吸取100 μl TY培养基重新悬浮沉淀，上下吹吸数次到均匀。取重新悬浮后的转化根瘤菌30 μl加入选择性平板中心，涂布。将选择平板在28℃下培养，1天后观察