载体选择和工程菌构建过程中应注意问题.pptVIP

载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题 一、获取目的基因 二、重组 三、转化 重组和转化需要共同注意的问题 目的基因的稳定性，酶切位点 载体的酶切位点，选择标记 载体的拷贝数，载体和受体的相容性 受体的表达系统 目的菌对密码子的偏爱 四、筛选 五、表达 * * 一、获取目的基因 二、重组 三、转化 反转录法 反转录-聚合酶链反应法 化学合成法 对已发现的基因的改造 载体选择 重组方法 受体细胞的选择 转化方法 方法 四、筛选 五、表达 筛选方法 注意的问题 抗性筛选，蓝白班筛选······ 是否容易产生抗性突变，是否有假阳性 融合表达 包含体表达 分泌型表达 表达方式 目的基因 来源 用途 （决定载体和受体细胞的选择） 克隆 表达 分泌型表达 融合表达 包含体表达 反转录法 反转录-聚合酶链反应法 化学合成法 对已发现的基因的改造 目的基因提取方法 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 M13噬菌体载体 噬菌粒载体 载体 （一）载体的选择 载体 表达型载体：如pUC18/19，pGEM-T载体 克隆型载体：如pBR322，TA载体 （二）重组方法：用T4DNA聚合酶将粘性末端连接起来 1.克隆基因的酶切位点问题 2.载体的酶切问题 3.连接片段浓度比的问题 需要考虑的问题： (1)黏性末端连接； (2)平末端连接； (3)同聚物接尾连接； (4)接头连接法。 （一）受体细胞的选择 大肠杆菌 枯草杆菌 链霉菌 酵母菌 昆虫细胞（家蚕） 哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO） 植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 常用的受体 大肠杆菌 用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms） 用于接受l-DNA：LE392、ED8654 酵母菌 哺乳动物细胞 CHO 毕赤酵母 啤酒酵母 （一）筛选方法 （二）注意事项 (1)遗传学方法 (2)物理筛选法 (3)核酸杂交法 (4)表达产物分析法 1.连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般连接粘性末端酶量的10-100倍。 　　?? 2.在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mgml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mgml。 　　? ?3.连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低效率。 　? ?4.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。 　　? 5.在连接反应中，如不对载体进行去5‘磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。 　　? ?6.麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。 　　? ?7.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-alactosidase)水解后生成的吲哚衍显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的。 　　? ?8.在含有X-gal和IPTG的筛选上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。 （一）分泌型表达 目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整 （二）包含体表达 能简化外源基因表达产物的分离操作 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 *